【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及使用方法，涉及c12q，具體涉及包含酶或微生物的測(cè)定或檢驗(yàn)方法。
技術(shù)介紹
1、肺癌是世界上發(fā)病率最高，致死率首位的惡性腫瘤，目前公認(rèn)的吸煙是引發(fā)肺癌最重要的高危因素，肺癌的診斷方法主要通過影像學(xué)檢查，痰液細(xì)胞學(xué)分析，組織穿刺樣本分析，在影像學(xué)檢查中最常用的是x光片和ct掃描，對(duì)高危人群進(jìn)行ct掃描篩查出早期肺癌，可以降低20％的肺癌致死率，但是低劑量的ct掃描對(duì)發(fā)現(xiàn)肺部微小結(jié)節(jié)危險(xiǎn)程度判斷具有局限性，因此需要在低劑量ct掃描的基礎(chǔ)上，對(duì)肺部微小結(jié)節(jié)做進(jìn)一步的分子生物學(xué)檢測(cè)。對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散分為四期，發(fā)現(xiàn)越早，肺癌的死亡率越低，因此在肺癌早期檢測(cè)出癌癥基因，可以極大的降低肺癌的死亡率。
2、中國(guó)專利技術(shù)專利cn201910054201.2公開了一種用于肺癌檢測(cè)的dna甲基化qpcr試劑盒及使用方法，通過利用血漿游離dna進(jìn)行甲基化qpcr以確定一個(gè)或多個(gè)基因靶點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來用于肺癌檢測(cè)或篩查，通過優(yōu)化特定核苷酸序列引物及dna探針，提高了檢測(cè)靈敏度，但是采用四個(gè)基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)，檢測(cè)不全面，在肺癌初期不易篩選到。中國(guó)專利技術(shù)專利cn202110626219.2公開了一種用于檢測(cè)肺癌相關(guān)基因甲基化的核酸組合物、試劑盒和檢測(cè)方法，對(duì)rassf1a基因位點(diǎn)，cdkn2a基因位點(diǎn)，ptger4基因位點(diǎn)，shox2基因位點(diǎn)的甲基化進(jìn)行特異性檢測(cè)，試劑盒具有檢測(cè)肺癌相關(guān)基因甲基化結(jié)果準(zhǔn)確、時(shí)效性快，檢測(cè)通量高、特異性好、敏感性好等優(yōu)點(diǎn)，但是該試劑盒的檢出限濃度較低，對(duì)于
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了降低肺癌相關(guān)基因甲基化檢測(cè)試劑盒的檢出限，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，本專利技術(shù)的第一個(gè)方面提供了一種肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸擴(kuò)增試劑，陰性參考品和陽(yáng)性參考品，所述核酸擴(kuò)增試劑包括反應(yīng)液和pcr混合液。
2、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述試劑盒針對(duì)檢測(cè)7種肺癌相關(guān)抑癌基因，包括zfp42，hoxa9，tac1，cdo1，sox17，rassf1a和shox2。
3、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液包括反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3的體積比為1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
4、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3的體積比為1：1：1。
5、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液1中包括tac1引物，tac1?fam熒光探針，hoxa9引物，hoxa9?cy5熒光探針，cdo1引物，cdo1?vic熒光探針。
6、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液2中包括zfp42引物，zfp42?fam熒光探針，sox17引物，sox17?cy5熒光探針，內(nèi)參基因actb引物，內(nèi)參基因actb?vic熒光探針。
7、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液3中包括rassf1a引物，rassf1afam熒光探針，shox2引物，shox2?cy5熒光探針，內(nèi)參基因actb引物，內(nèi)參基因actb?vic熒光探針。
8、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述引物與熒光探針的基因序列見表1。
9、表1
10、
11、
12、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3中包含引物和熒光探針，所述引物的摩爾濃度為0.2-0.3μm，所述熒光探針的摩爾濃度為0.05-0.15μm。
13、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3中包含引物和熒光探針，所述引物的摩爾濃度為0.25μm，所述熒光探針的摩爾濃度為0.1μm。
14、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述pcr混合液中的原料以摩爾濃度計(jì)包括dntps250μm、kcl25mm-100mm、tris-hcl10-200mm、mgcl21.0mm-25mm、dtt0.1mm-1mm、水為溶劑。
15、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述陰性參考品包括正常人外周血dna，緩沖液te和水，水為溶劑。
16、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述陽(yáng)性參考品包括肺癌細(xì)胞株基因組dna，緩沖液te和水，水為溶劑。所述肺癌細(xì)胞株基因組dna的質(zhì)量濃度為0.1ng/μl。
17、申請(qǐng)人在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)試劑盒對(duì)7個(gè)基因甲基化進(jìn)行檢測(cè)，可以提高癌癥基因檢測(cè)的準(zhǔn)確度，實(shí)現(xiàn)7個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢出率達(dá)到100％的技術(shù)效果。猜測(cè)可能的原因是：部分抑癌基因的甲基化在癌癥初期對(duì)于癌癥的準(zhǔn)確檢測(cè)，甲基化概率大約為65-85％，有部分癌癥細(xì)胞在癌癥初期不會(huì)引發(fā)抑癌基因甲基化，造成了癌癥初期對(duì)于癌癥的發(fā)生篩選不準(zhǔn)確，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)間，本專利技術(shù)試劑盒通過對(duì)7中基因甲基化進(jìn)行檢測(cè)，可以提高檢測(cè)的全面性，在癌癥初期篩選出癌變基因，早治療。申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，采用pcr擴(kuò)增結(jié)合熒光標(biāo)記法進(jìn)行定量檢測(cè)可以提高檢測(cè)的靈敏度，使檢測(cè)限達(dá)到5-50pg，原因是：通過引入特異性引物和聚合酶，用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記，使目標(biāo)基因擴(kuò)增，從而在微量血漿游離dna樣本中最大限度地檢測(cè)出多個(gè)基因的甲基化，降低檢出限。
18、本專利技術(shù)的第二個(gè)方面提供了一種肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
19、(1)抽提游離dna；
20、(2)甲基化檢測(cè)前樣本處理；
21、(3)pcr熒光檢測(cè)：熒光pcr試劑準(zhǔn)備，pcr擴(kuò)增，pcr檢測(cè)；
22、(4)結(jié)果判斷。
23、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟1為取外周血樣本血漿3ml，使用血漿游離dna抽提試劑盒進(jìn)行核酸提取。
24、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟2為取10μl步驟1提取的dna樣本，使用dna重亞硫酸酸鹽轉(zhuǎn)化及純化試劑盒處理dna樣本。
25、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟3中熒光pcr試劑準(zhǔn)備的步驟為先將反應(yīng)液1，反應(yīng)液2，反應(yīng)液3與pcr混合液，25℃融化并混勻，離心后分裝于熒光pcr96-孔板內(nèi)，再加入處理后的dna樣本，混勻，待測(cè)。
26、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液與pcr混合液，dna樣本的體積比為(6-8)：(12-15)：(4-6)。
27、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述反應(yīng)液與pcr混合液，dna樣本的體積比為7：13：5。
28、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述熒光pcr96-孔板的分裝量為20μl，所述熒光pcr96-孔板的分布如表2所示：
29、表2
30、
31、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟3中pcr擴(kuò)增的條件為：94-97℃預(yù)變性3-8min；然后進(jìn)行pcr循環(huán)：93-95℃，15個(gè)循環(huán)，55-65℃，30個(gè)循環(huán)，70-75℃，30個(gè)循環(huán)，在55-65℃進(jìn)行循環(huán)時(shí)收集熒光信號(hào)。
32、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟3中pcr擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸擴(kuò)增試劑，陰性參考品和陽(yáng)性參考品，所述核酸擴(kuò)增試劑包括反應(yīng)液和PCR混合液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒針對(duì)檢測(cè)7種肺癌相關(guān)抑癌基因，包括ZFP42，HOXA9，TAC1，CDO1，SOX17，RASSF1A和SHOX2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液包括反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3的體積比為1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液1中包括TAC1引物，TAC1?FAM熒光探針，HOXA9引物，HOXA9Cy5熒光探針，CDO1引物，CDO1VIC熒光探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液2中包括ZFP42引物，ZFP42?FAM熒光探針，SOX17引物，SOX17Cy5熒光探針，內(nèi)參基
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液3中包括RASSF1A引物，RASSF1A?FAM熒光探針，SHOX2引物，SHOX2?Cy5熒光探針，內(nèi)參基因ACTB引物，內(nèi)參基因ACTB?VIC熒光探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3中包含引物和熒光探針，所述引物的摩爾濃度為0.2-0.3μM，所述熒光探針的摩爾濃度為0.05-0.15μM。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟3中熒光PCR試劑準(zhǔn)備的步驟為先將反應(yīng)液1，反應(yīng)液2，反應(yīng)液3與PCR混合液25℃融化并混勻，離心后分裝于熒光PCR96-孔板內(nèi)，再加入處理后的DNA樣本，混勻，待測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟3中PCR擴(kuò)增的條件為：94-97℃預(yù)變性3-8min；然后進(jìn)行PCR循環(huán)：93-95℃，15個(gè)循環(huán)，55-65℃，30個(gè)循環(huán)，70-75℃，30個(gè)循環(huán)，在55-65℃進(jìn)行循環(huán)時(shí)收集熒光信號(hào)。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸擴(kuò)增試劑，陰性參考品和陽(yáng)性參考品，所述核酸擴(kuò)增試劑包括反應(yīng)液和pcr混合液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒針對(duì)檢測(cè)7種肺癌相關(guān)抑癌基因，包括zfp42，hoxa9，tac1，cdo1，sox17，rassf1a和shox2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液包括反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3，所述反應(yīng)液1，反應(yīng)液2和反應(yīng)液3的體積比為1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液1中包括tac1引物，tac1?fam熒光探針，hoxa9引物，hoxa9cy5熒光探針，cdo1引物，cdo1vic熒光探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液2中包括zfp42引物，zfp42?fam熒光探針，sox17引物，sox17cy5熒光探針，內(nèi)參基因actb引物，內(nèi)參基因actb?vic熒光探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述肺癌相關(guān)7基因甲基化聯(lián)合檢...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柯中和，尹俊，熊慧，謝立群，胡仕婕，肖曉，杜超翔，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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