【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，特別是一種可離子化脂質(zhì)分子、其制備方法及其在制備脂質(zhì)納米顆粒的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、治療性核酸包括小型干擾rna(sirna)、微rna(mirna)、信使rna(mrna)。此類核酸通過多種機(jī)制起作用。在sirna或mirna的情況下，可通過rna干擾(rnai)的方法下調(diào)特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)水平。將sirna或mirna引入細(xì)胞質(zhì)后，sirna或mirna可結(jié)合risc蛋白質(zhì)，其有義鏈被risc復(fù)合體移走，因而在risc內(nèi)提供了可識別并結(jié)合具有針對結(jié)合的sirna或mirna序列的互補(bǔ)序列的mrna的模板。在結(jié)合互補(bǔ)mrna后，risc復(fù)合體切割mrna并且釋放切割的鏈。rnai可通過相應(yīng)的編碼蛋白質(zhì)合成的mrna的靶向特異性破壞來提供特定蛋白質(zhì)的下調(diào)。
2、rnai技術(shù)的治療性應(yīng)用極其廣泛，因為可用針對靶蛋白的任意核苷酸序列來構(gòu)建相對應(yīng)的sirna或mirna。目前，sirna或mirna構(gòu)建體已在體外和體內(nèi)模型中顯示出特異性下調(diào)靶蛋白的能力。然而，sirna或mirna用作全身性治療劑將面臨兩個問題。其一，它們對血漿中的核酸酶非常敏感；其二，當(dāng)全身性施用sirna或mirna時，其進(jìn)入可在其中結(jié)合risc的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的能力有限。為穩(wěn)定此類雙鏈分子，可在分子內(nèi)摻入經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸連接體，例如硫代磷酸酯基團(tuán)。然而，這種化學(xué)修飾只能提供有限的保護(hù)作用，并且可能降低分子的活性。其他方法包括使用載體遞送系統(tǒng)諸如聚合物、可離子化脂質(zhì)分子，或?qū)Υ祟愲p鏈分子進(jìn)行化學(xué)修飾(例如通過共價連接可離子化脂質(zhì)分子)
3、mrna通過轉(zhuǎn)移存儲在dna中的指令來控制活細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)合成。mrna治療是利用化學(xué)修飾后的mrna分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，利用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自有核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，生成機(jī)體所需要的蛋白質(zhì)。mrna疫苗是將mrna在體外進(jìn)行相關(guān)的修飾后傳遞至機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并產(chǎn)生蛋白抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應(yīng)答，進(jìn)而擴(kuò)大機(jī)體的免疫能力。理論上，mrna能夠表達(dá)任何蛋白質(zhì)，因此可來治療各種疾病和生產(chǎn)各類疫苗。
4、mrna可分為非復(fù)制性mrna(nonreplicating?mrna)和自擴(kuò)增mrna(self-amplifying?mrna)兩類：非復(fù)制性mrna僅編碼目標(biāo)蛋白并包含5’和3’非翻譯區(qū)(utr)；自擴(kuò)增mrna不僅編碼目標(biāo)蛋白，而且還編碼能夠使細(xì)胞內(nèi)rna擴(kuò)增和蛋白表達(dá)的復(fù)制機(jī)制。與非復(fù)制性mrna相比，自擴(kuò)增mrna可以持續(xù)大量表達(dá)目標(biāo)蛋白，即在同樣地治療或免疫效果的前提下，施用更少的劑量。
5、基于mrna的治療的挑戰(zhàn)之一是半衰期短，可被大量細(xì)胞外rna酶迅速降解。此外是其免疫原性，即外源性rna通常被機(jī)體視為病毒感染的信號。可通過對mrna結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種化學(xué)修飾，例如修改5'-帽，多聚腺苷酸(a)尾部，5'-和3'-utr以及編碼區(qū)域，替換天然腺苷為n1-甲基腺苷(m1a)或n6-甲基腺苷(m6a)，來穩(wěn)定mrna空間結(jié)構(gòu)并且降低免疫原性以實現(xiàn)蛋白的高表達(dá)水平。另外，由于mrna的大小明顯大于sirna或mirna構(gòu)建體，大多數(shù)細(xì)胞對mrna的攝入效率低。迄今為止，研究人員已使用基于各種脂質(zhì)材料的載體遞送系統(tǒng)，例如各種囊泡，脂質(zhì)體，脂質(zhì)納米顆粒(lnp)，脂質(zhì)乳劑，脂質(zhì)植入物等，遞送化學(xué)修飾或未修飾的mrna進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。
6、核酸(nucleic?acids，rna)在調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白表達(dá)方面具有巨大的治療潛力，但裸rna被細(xì)胞內(nèi)化的效率極低，并且其在體內(nèi)遞送過程中容易被腎臟快速清除，或者被體內(nèi)rna酶快速降解，其實際療效大打折扣。為了更安全有效地發(fā)揮rna的治療能力，科學(xué)家使用脂質(zhì)納米顆粒(lnp)來封裝和傳遞rna到機(jī)體特定部位。這種rna遞送策略在遞送雙鏈小干擾rna(sirnas，21到23個核苷酸長度)方面展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用價值。比如類脂質(zhì)c12-200已被廣泛用于制作sirna-lnp制劑，用于體內(nèi)各種治療應(yīng)用，以抑制蛋白表達(dá)。人工合成的可電離脂質(zhì)材料(synthetic?ionizable?lipids)和類脂質(zhì)材料(lipid-like?materials)出現(xiàn)后，不僅大大降低了lnp的體內(nèi)毒性，還使得體內(nèi)遞送大分子量rna(比如mrna)成為可能。這些含胺的可電離脂質(zhì)或類脂質(zhì)分子帶正電荷，通過靜電吸引的方式，可以高效的與帶負(fù)電荷的mrna結(jié)合并自組裝形成lnp。lnp能夠提高rna的血液循環(huán)時間，并提高細(xì)胞的攝取率；在細(xì)胞內(nèi)rna通過內(nèi)體逃逸途徑，釋放到細(xì)胞質(zhì)中，得以表達(dá)出特定的蛋白，起到一定的治療作用。
7、lnp的原料成分主要有以下4種：1)可電離脂質(zhì)或類脂質(zhì)分子(如dlin-kc2-dma、dlin-mc3-dma、l319)。這是實現(xiàn)體內(nèi)遞送mrna的核心成分。2)磷脂分子，是一種磷脂，它為lnp雙分子層提供結(jié)構(gòu)，也可能有助于核內(nèi)體逃逸；3)膽固醇，增強(qiáng)lnp穩(wěn)定性，促進(jìn)膜融合；4)聚乙二醇例如dmg-peg2000，它可以控制并減少lnp的粒徑，并“保護(hù)”lnp不受免疫細(xì)胞非特異性內(nèi)吞作用的影響。
8、在體內(nèi)，lnp的原料和組分變化會對mrna-lnp制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性和mrna作用效力產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。現(xiàn)有的lnp組分方案無法充分的發(fā)揮mrna-lnp制劑的效力，需要持續(xù)對可離子化脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)調(diào)整并針對特定rna進(jìn)行設(shè)計優(yōu)化，本專利技術(shù)解決這樣的問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種可離子化脂質(zhì)分子、其制備方法、包含其的組合物、其在制備用作將核酸遞送至細(xì)胞的載體中的應(yīng)用及其在制備脂質(zhì)納米顆粒lnp的應(yīng)用，通過改進(jìn)可離子化脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)并對lnp組分方案的調(diào)整，提高mrna-lnp制劑的作用效力。
2、為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本專利技術(shù)采用如下的技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，所述可離子化脂質(zhì)分子具有式(i)的結(jié)構(gòu)：
4、
5、其中，
6、q選自苯環(huán)、環(huán)戊基、環(huán)己基、吡咯環(huán)或嘧啶環(huán)；
7、l1和l4各自獨(dú)立地選自–o(c＝o)-、-(c＝o)o-或碳-碳雙鍵；
8、l2和l3各自獨(dú)立地選自-(ch2)xo-或-o(ch2)x-，其中x為0至4之間的整數(shù)；
9、l5選自-(ch2)y–o(c＝o)-、-(ch2)y-(c＝o)o-或-(ch2)y-o-，其中y為0至4之間的整數(shù)；
10、l2、l3、l5各自獨(dú)立地分別與q中的任意3個位點(diǎn)連接，所述位點(diǎn)為碳或者氮；
11、a和d各自獨(dú)立地為0至18的整數(shù)；
12、b和c各自獨(dú)立地為1至18的整數(shù)；
13、e為1至5的整數(shù)；
14、r1和r10各自獨(dú)立地選自甲基或環(huán)烴基；
15、r2和r3各自獨(dú)立地選自h或c1-c12烴基；或者r2選自h或c1-c12烴基本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，所述可離子化脂質(zhì)分子具有式(I)的結(jié)構(gòu)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，Q選自苯環(huán)、環(huán)戊基或者環(huán)己基；優(yōu)選地，Q為苯環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，L2、L3、L5與Q的連接方式為1,2,5-三取代、1,3,5-三取代、1,2,4-三取代、1,4,5-三取代或1,3,6-三取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，y為0、1或2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，a和d各自獨(dú)立地為6至10的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，b和c各自獨(dú)立地為1至10的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，e選自2或3。
8.根
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子選自如下化合物：
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物一：
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物二：
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物三：
13.一種制備權(quán)利要求1-10任一項所述可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體的方法，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物一，所述方法包括如下步驟：
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，檢測顯示反應(yīng)完成的方法為TLC硅膠板薄層色譜。
15.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-12任一項所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，以及治療劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中，所述治療劑包括核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中，所述核酸選自小型干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中mRNA為非自復(fù)制mRNA或自復(fù)制mRNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求15-18任一項所述的組合物，其中，所述組合物還包含一種或多種選自中性脂質(zhì)、甾族化合物和聚合物綴合的脂質(zhì)中的賦形劑；
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中，可離子化脂質(zhì)分子與中性脂質(zhì)的摩爾比為2:1至8:1，可離子化脂質(zhì)分子與膽固醇的摩爾比為2:1至1:1；可離子化脂質(zhì)分子與聚乙二醇化的DMG的摩爾比為100:1至25:1。
21.權(quán)利要求1-12任一項所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體用作制備將核酸遞送至細(xì)胞的載體中的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，所述核酸選自小型干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中mRNA為非自復(fù)制mRNA或自復(fù)制mRNA。
24.一種權(quán)利要求1-12任一項所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體在制備脂質(zhì)納米顆粒中的應(yīng)用，包括：將可離子化脂質(zhì)分子與磷脂、膽固醇、聚乙二醇通過合成獲得脂質(zhì)體納米顆粒LNP，所述LNP能提高負(fù)載物-mRNA在細(xì)胞內(nèi)的翻譯表達(dá)水平。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子選自化合物一至化合物三：
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25或26所述的應(yīng)用，其中，所述磷脂為DSPC或者DOPE；所述聚乙二醇為DMG-PEG2000。
27.根據(jù)權(quán)利要求24或25或26所述的應(yīng)用，其中，合成載體LNP的配方按照的摩爾百分比為：可離子化脂質(zhì)分子：膽固醇：磷脂：聚乙二醇＝20-70％：20-60％：2-20％：0.1-5％。
28.根據(jù)權(quán)利要求24或25或26所述的應(yīng)用，其中，當(dāng)使用化合物一時，合成載體LNP的配方按照的摩爾百分比為：可離子化脂質(zhì)分子：膽固醇：DSPC：DMG-PEG2000＝31.5...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，所述可離子化脂質(zhì)分子具有式(i)的結(jié)構(gòu)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，q選自苯環(huán)、環(huán)戊基或者環(huán)己基；優(yōu)選地，q為苯環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，l2、l3、l5與q的連接方式為1,2,5-三取代、1,3,5-三取代、1,2,4-三取代、1,4,5-三取代或1,3,6-三取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，y為0、1或2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，a和d各自獨(dú)立地為6至10的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，b和c各自獨(dú)立地為1至10的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，e選自2或3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子選自如下化合物：
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物一：
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物二：
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物三：
13.一種制備權(quán)利要求1-10任一項所述可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體的方法，其中，所述可離子化脂質(zhì)分子為化合物一，所述方法包括如下步驟：
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其中，檢測顯示反應(yīng)完成的方法為tlc硅膠板薄層色譜。
15.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-12任一項所述的可離子化脂質(zhì)分子、其藥學(xué)上可接受的鹽及其立體異構(gòu)體，以及治療劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中，所述治療劑包括核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中，所述核酸選自小型干擾rna(s...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王子豪，
申請(專利權(quán))人：嘉晨西海杭州生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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