【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學工程，具體涉及一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)。
技術(shù)介紹
1、外泌體是由多種細胞分泌到細胞外微環(huán)境中大小為30-150nm的膜囊泡。在其生物過程中，外泌體被包裝成蛋白質(zhì)、rna、脂質(zhì)和其他生物分子，對生物醫(yī)學研究和治療具有重要意義。外泌體是小的細胞外囊泡由許多細胞類型分泌，與細胞間的通訊相關，可以在體液中被檢測到，在目前的研究中其具有以下作用及優(yōu)點：1)疾病生物標志物的高度穩(wěn)定的儲存庫；2)作為藥物的載體，尺寸較小可以有效穿過血腦屏障以靶向給藥，降低血管栓塞風險；3)具有良好的生物相容性，在完成其功能后被生物體逐漸降解和清除，減少對生物體的長期影響，其毒性和副作用也較小；4)自身攜帶大量生物活性分子，包括編碼和非編碼rna、蛋白質(zhì)和核酸，這些分子可以調(diào)節(jié)細胞過程并調(diào)節(jié)組織修復以調(diào)節(jié)細胞反應，從而使其成為治療干預的多功能工具，且其免疫源性極小。但外泌體目前缺乏規(guī)模化生產(chǎn)的方法，導致其臨床轉(zhuǎn)化收到限制。雖然外泌體可以從多種生物樣本中提取，如血清、尿液、細胞培養(yǎng)上清液等，但不同來源的外泌體在作用上可能會產(chǎn)生差異，因此在提取時應根據(jù)需求選擇合適的樣本來源。外泌體通常存在于復雜的生物樣本中，并且與其他細胞碎片、蛋白質(zhì)和rna等混合在一起，提取過程中需要富集和純化以確保獲得高純度的外泌體樣品，還需注意避免受到環(huán)境因素的影響如溫度、ph值、離子濃度等發(fā)生損傷和降解。當前對于外泌體的提純方法主要是超速離心、梯度離心、超濾和免疫親和層析等。1)超速離心：利用不同細胞成分的密度差異，在多次離心過程中逐步分離外泌體，需要先低
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、解決的技術(shù)問題：
2、本申請針對現(xiàn)有外泌體目前缺乏規(guī)模化生產(chǎn)的方法，導致其臨床轉(zhuǎn)化收到限制，不同來源的外泌體在作用上可能會產(chǎn)生差異，超速離心無法完全排除污染物，梯度離心操作較為復雜，需要較長的時間，超濾無法排除污染物并且可能會對外泌體造成損傷，免疫親和層析操作較復雜，外泌體提純方法成本較高，效率低、易產(chǎn)生低純度的囊泡等等技術(shù)問題，提供了一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)；本專利技術(shù)方法能通過更少的樣品同時獲得純度較高的外泌體。
3、技術(shù)方案：
4、為實現(xiàn)上述目的，本申請通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
5、一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，具體包括以下步驟：
6、s1、將含有外泌體的生物樣品加入到加樣區(qū)，通過加樣區(qū)后分支到一組微管道中，每條微管道中均設有一個濾徑150nm的濾網(wǎng)，經(jīng)過濾網(wǎng)分離后液體進入外泌體捕獲區(qū)；
7、s2、液體進入外泌體捕獲區(qū)后，液體中外泌體會和捕獲區(qū)內(nèi)親和層析填料上的抗體進行特異性結(jié)合，能夠更為準確的識別出外泌體捕獲；
8、s3、在捕獲區(qū)對其他150nm以下的非特異性結(jié)合的分子進行緩沖液清洗，以1000微米/秒流速進行充分的清洗，清洗后的緩沖液單向流動流入收集區(qū)進行廢液收集，緩沖液清洗3次，每次清洗10-20分鐘，廢液收集采用吸取的方式，在收集區(qū)廢液吸清后再進行下一步；
9、s4、通過加入洗脫液對與親和層析填料特異性結(jié)合的外泌體進行洗脫收集，洗脫液在捕獲區(qū)與親和層析填料充分反應1個小時，反應過后在收集區(qū)收集洗脫液，外泌體會存在于洗脫液中，離心洗脫液獲取純度較高的外泌體；
10、s5、在收集區(qū)加入緩沖液沖洗整個裝置，緩沖液在微管道內(nèi)沖洗3次，沖洗后廢液在加樣區(qū)進行收集；親和層析填料在2-3次使用后對親和層析填料進行更換。
11、進一步地，所述s1中含有外泌體的生物樣品為血清、尿液或細胞培養(yǎng)上清液。
12、進一步地，所述s1中加樣區(qū)后的微管道設有6支。
13、進一步地，所述s2中特異性結(jié)合1-2小時。
14、進一步地，所述s2中親和層析填料采用硅膠材料便于保存，在硅膠表面上預先固定與外泌體能夠特異性結(jié)合的抗體。
15、進一步地，所述s2中抗體為外泌體相關特異性抗體，具體為cd9、cd63、alix、annexin、epcam、rab5中的一種或幾種。
16、進一步地，所述s3中用pbs作為緩沖液，用量為樣品用量的兩倍。
17、進一步地，所述s4中洗脫液為酸性洗脫液，酸性洗脫液可以破壞硅膠表面的硅氧烷鍵從而釋放外泌體，酸性洗脫液為醋酸鹽緩沖液，洗脫液用量為樣品用量的兩倍；離心速度30000rpm，離心時間60min。
18、進一步地，所述s4中離心后獲取純度較高的外泌體采用納米粒度分析儀、透射電子顯微鏡評估外泌體的分離和純化效果。
19、進一步地，所述s5中用pbs作為緩沖液，用量為樣品用量的兩倍。
20、本申請技術(shù)原理為：高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)本體使用pmds(聚二甲基硅氧烷)或pmma(聚甲基丙烯甲酯)，在系統(tǒng)內(nèi)設計多個微管道，微管道內(nèi)濾網(wǎng)的尺寸基于外泌體的大小(30-150nm)可以有效分離外泌體和其他細胞成分，親和層析填料采用硅膠材料，特異性抗體或配體已經(jīng)預先結(jié)合在硅膠填料中，基于尺寸排除后再通過特異性抗體或配體提高外泌體的選擇性捕獲；通過濾網(wǎng)分離與親和層析填料特異性捕獲協(xié)同使用，進一步提高純化效率；再通過納米粒度分析儀、透射電子顯微鏡等方法評估外泌體的分離和純化效果。
21、有益效果：
22、本申請?zhí)峁┝艘环N高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具備以下有益效果：
23、1.與已有的提取外泌體技術(shù)相比較本技術(shù)在提高外泌體提純效率和純度方面具有顯著潛力，可推動外泌體相關研究和應用的發(fā)展；
24、2.高效性：相比傳統(tǒng)方法，大幅提高外泌體的分離和純化效率；
25、3.操作簡便：自動化系統(tǒng)減少操作復雜性，提高用戶友好性；
26、4.成本效益：降低材料和操作成本，適用于大規(guī)模生產(chǎn)和實驗室；
27、5.高純度：提高外泌體的純度，有利于后續(xù)的生物醫(yī)學應用；
28、6.該系統(tǒng)在基于尺寸排除原理后再進行特異性捕獲即可實現(xiàn)了高效、低成本、操作簡便的外泌體提純；
29、7.該技術(shù)在生物醫(yī)學研本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，具體包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，所述S1中含有外泌體的生物樣品為血清、尿液或細胞培養(yǎng)上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，所述S1中加樣區(qū)后的微管道設有6支。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S2中特異性結(jié)合1-2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S2中親和層析填料采用硅膠材料便于保存，在硅膠表面上預先固定與外泌體能夠特異性結(jié)合的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S2中抗體為外泌體相關特異性抗體，具體為CD9、CD63、ALIX、ANNEXIN、EpCAM、RAB5中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S3中用PBS作為緩沖液，用量為樣品用量的兩倍。
8.根據(jù)
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S4中離心后獲取純度較高的外泌體采用納米粒度分析儀、透射電子顯微鏡評估外泌體的分離和純化效果。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述S5中用PBS作為緩沖液，用量為樣品用量的兩倍。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，具體包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，所述s1中含有外泌體的生物樣品為血清、尿液或細胞培養(yǎng)上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于，所述s1中加樣區(qū)后的微管道設有6支。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述s2中特異性結(jié)合1-2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述s2中親和層析填料采用硅膠材料便于保存，在硅膠表面上預先固定與外泌體能夠特異性結(jié)合的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種高效微流控外泌體分離與純化系統(tǒng)，其特征在于：所述s2中抗體為外泌體相關特異性抗體，具體為cd9、cd63、ali...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王國華，顧文惠，李港，劉方明，魏天嬌，向超，陶冶，
申請(專利權(quán))人：南通大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。