【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本公開涉及用于挽救基因功能以及治療和預防疾病或病癥(例如，bestrophin病)的方法、組合物和系統。關于聯邦政府資助的研究或開發的聲明本專利技術是在由美國國家衛生研究院授予的ey028758和gm127652下的政府支持下完成的。政府具有本專利技術中的一定權利。序列表聲明隨附提交的標題為“40036-601_序列表_st25”，創建于2022年4月13日，文件大小為2,086字節的計算機可讀序列表的文本，在此通過引用以其整體并入。
技術介紹
0、專利技術背景
1、人best1基因編碼主要在視網膜色素上皮(rpe)中表達的ca2+激活的cl-通道(best1)，該基因的基因突變導致一系列視網膜退行性病癥，通常稱為bestrophin病(bestrophinopathy)。迄今為止，best1突變的病理機制仍不清楚，因此，沒有有效的治療或預防策略。
技術實現思路
1、本文提供了用于挽救基因功能以及治療和預防疾病和病癥(例如，bestrophin病)的方法。在一些實施方案中，方法包括將有效量的以下引入到細胞中：成簇規律間隔短回文重復(crispr)-cas系統，或編碼crispr-cas系統的一種或多種核酸，其被配置為敲除或至少部分沉默靶內源基因的兩個等位基因；以及編碼靶內源基因的外源功能性形式的核酸。
2、在一些實施方案中，crispr-cas系統包含至少一種cas蛋白和至少一種grna，其中每種grna配置為與編碼靶內源基因的核酸序列的一部分雜交。在一些實
3、在一些實施方案中，該一種或多種核酸包括一種或多種信使rna、一種或多種載體、或其組合。
4、在一些實施方案中，crispr-cas系統是crispr干擾(crispri)系統。在一些實施方案中，crispri系統包含：至少一種cas蛋白；至少一種grna，其中每種grna配置為與編碼靶內源基因的核酸序列的一部分雜交；以及轉錄阻遏物。在一些實施方案中，cas蛋白和轉錄阻遏物作為融合蛋白或編碼其的核酸提供。在一些實施方案中，轉錄阻遏物和cas蛋白或至少一種grna各自包含來自募集系統的結合對的一半。在一些實施方案中，cas蛋白是無催化活性的。在一些實施方案中，cas蛋白是cas9、cas12a和cas14。
5、在一些實施方案中，cas蛋白、至少一種grna以及轉錄阻遏物(當包含時)在單個核酸上提供。在一些實施方案中，單個核酸是載體。在一些實施方案中，單個核酸是桿狀病毒載體或慢病毒載體。
6、在一些實施方案中，靶內源基因是疾病相關聯的基因。在一些實施方案中，靶內源基因的至少一個等位基因具有功能獲得突變。在一些實施方案中，靶內源基因的至少一個等位基因具有功能喪失突變。在一些實施方案中，靶內源基因是best1。在一些實施方案中，best1基因包含d203a突變、i205t突變或y236c突變。
7、在一些實施方案中，細胞是體內的。在一些實施方案中，引入到細胞中包括施用至受試者。
8、在一些實施方案中，受試者患有或疑似患有眼部疾病或眼部病癥。在一些實施方案中，受試者患有或疑似患有神經退行性疾病。在一些實施方案中，疾病或病癥包括best卵黃狀黃斑營養不良(bvmd)、常染色體隱性bestrophin病(arb)、成人發病的卵黃狀營養不良(avmd)、常染色體顯性玻璃體視網膜脈絡膜病變(advirc)、或色素性視網膜炎(rp)。在一些實施方案中，該方法治療或預防受試者中的疾病或病癥。
9、本文還提供了包括以下的系統：成簇規律間隔短回文重復(crispr)-cas系統，或編碼crispr-cas系統的一種或多種核酸，其被配置為敲除或至少部分沉默靶內源基因的兩個等位基因；以及編碼靶內源基因的外源功能性形式的核酸。
10、在一些實施方案中，crispr-cas系統包括至少一種cas蛋白和至少一種grna，其中每種grna配置為與編碼靶內源基因的核酸序列的一部分雜交。在一些實施方案中，該至少一種grna配置為不與靶內源基因的外源功能性形式雜交。在一些實施方案中，靶內源基因的外源功能性形式包含與靶內源基因的核酸序列不同的核酸序列，并且編碼多肽，該多肽包含與靶內源基因的野生型形式的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。
11、在一些實施方案中，該一種或多種核酸包括一種或多種信使rna、一種或多種載體、或其組合。
12、在一些實施方案中，crispr-cas系統是crispr干擾(crispri)系統。在一些實施方案中，crispri系統包括：至少一種cas蛋白；至少一種grna，其中每種grna配置為與編碼靶內源基因的核酸序列的一部分雜交；以及轉錄阻遏物。在一些實施方案中，cas蛋白和轉錄阻遏物作為融合蛋白或編碼其的核酸提供。在一些實施方案中，轉錄阻遏物和cas蛋白或至少一種grna各自包含來自募集系統的結合對的一半。在一些實施方案中，cas蛋白是無催化活性的。在一些實施方案中，cas蛋白是cas9、cas12a和cas14。
13、在一些實施方案中，cas蛋白、至少一種grna以及轉錄阻遏物(當包含時)在單個核酸上提供。在一些實施方案中，單個核酸是載體。在一些實施方案中，單個核酸是桿狀病毒載體或慢病毒載體。
14、在一些實施方案中，靶內源基因是疾病相關聯的基因。在一些實施方案中，靶內源基因的至少一個等位基因具有功能獲得突變。在一些實施方案中，靶內源基因的至少一個等位基因具有功能喪失突變。在一些實施方案中，靶內源基因是best1。在一些實施方案中，best1基因包含d203a突變、i205t突變或y236c突變。
15、本文進一步提供了在有此需要的受試者中延遲發作、治療、預防和/或治愈神經退行性疾病的方法，其包括將有效量的一種或多種包含crispr系統的病毒載體，以及編碼內源基因的野生型等位基因的核酸施用至受試者，其中該crispr系統沉默內源基因的兩個等位基因。本文進一步提供了恢復基因功能的方法，其包括施用有效量的一種或多種包含crispr系統的病毒載體，以及編碼內源基因的野生型等位基因的核酸，其中該crispr系統沉默內源基因的兩個等位基因。
16、在一些實施方案中，該基因是best1。在一些實施方案中，受試者具有內源基因中的功能獲得突變。在一些實施方案中，受試者具有內源基因中的功能喪失突變。
17、在一些實施方案中，病毒載體是桿狀病毒或慢病毒。在一些實施方案中，功能獲得突變是d203a、i205t或y236c。在一些實施方案中，包含crispr系統的病毒載體包含基于桿狀病毒的沉默(bvsi)載體，其含有cmv啟動子驅動的dcas9-krab-本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.方法，其包括
2.權利要求1所述的方法，其中所述Cas蛋白和所述轉錄阻遏物作為融合蛋白或編碼其的核酸提供。
3.權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述Cas蛋白是無催化活性的。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9、Cas12a和Cas14。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述Cas蛋白、所述至少一種gRNA和所述轉錄阻遏物在單個核酸上提供。
6.權利要求5所述的方法，其中所述單個核酸是桿狀病毒載體或慢病毒載體。
7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述靶內源基因是疾病相關聯的基因。
8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述細胞是體內的。
9.權利要求8所述的方法，其中引入到細胞中包括施用至受試者。
10.權利要求9所述的方法，其中所述受試者患有或疑似患有選自由神經退行性疾病和眼部疾病組成的組的疾病或病癥。
11.權利要求10所述的方法，其中所述疾病或病癥包括Best卵黃狀黃斑營養不良(BVMD)、常
12.權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述靶內源基因是BEST1。
13.權利要求12所述的方法，其中所述BEST1包含D203A突變、I205T突變或Y236C突變。
14.系統，其包括：
15.權利要求14所述的系統，其中所述靶內源基因是BEST1。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.方法，其包括
2.權利要求1所述的方法，其中所述cas蛋白和所述轉錄阻遏物作為融合蛋白或編碼其的核酸提供。
3.權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述cas蛋白是無催化活性的。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述cas蛋白是cas9、cas12a和cas14。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述cas蛋白、所述至少一種grna和所述轉錄阻遏物在單個核酸上提供。
6.權利要求5所述的方法，其中所述單個核酸是桿狀病毒載體或慢病毒載體。
7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述靶內源基因是疾病相關聯的基因。
8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述細胞是體內的。
9.權利要求8所述的方法，其中...
【專利技術屬性】
技術研發人員：T·楊，S·H·曾，Y·張，
申請(專利權)人：紐約市哥倫比亞大學理事會，
類型：發明
國別省市：
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