【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于熒光成像及生物傳感，涉及一種檢測ne(去甲基腎上腺素)的熒光探針及其制備方法，以及其在細胞成像與生物傳感中的應用。
技術介紹
1、了解中樞神經系統(cns)中的神經遞質如何影響神經內分泌系統、情緒調節的神經回路和認知之間復雜的相互作用，是現代神經科學的一個重大挑戰。去甲腎上腺素(ne)是人類大腦中樞神經系統的主要兒茶酚胺神經遞質之一，在新陳代謝、穩態平衡、情感障礙的病理生理學和其他生理功能中發揮著重要作用。其功能障礙也與神經退行性疾病和精神疾病密切相關，如帕金森病(pd)、阿爾茨海默病(ad)、癲癇、抑郁癥和精神分裂癥。因此，監測腦ne的變化對于了解和研究其在腦部疾病發展中的作用機制，以及進一步預防、診斷和治療腦部疾病具有重要意義。
2、在各種分析方法中，熒光探針因其高靈敏度、超強的時空分辨率、操作簡單、實時檢測以及非侵入性，已成為生物分子監測和細胞內成像的最有希望的技術。到目前為止，設計用于快速、特異和敏感的ne檢測的熒光探針仍然是一項具有挑戰性的任務。首先，ne的結構和反應性與其他兩種神經遞質，腎上腺素(ep)和多巴胺(da)非常相似。其次，ne在神經系統中的釋放和再攝取，其發生的時間尺度為毫秒至秒，所涉及的濃度相對較低(納摩爾濃度)。最重要的是，大腦結構和神經系統的復雜性使得我們很難在分子水平和細胞內及深層腦區的實時動態中解開ne水平異常與精神疾病之間的聯系。因此，非常迫切需要建立一種新的途徑來實時監測活體大腦中ne傳遞的復雜通訊信號，這種測量技術能夠無創、高空間和時間分辨率、高靈敏度、高化學特異
技術實現思路
1、本專利技術創新提供了一種ne熒光探針及其制備方法，以及其在細胞成像與生物傳感中的應用。本專利技術提供的新型ne熒光探針(包括但不限于式2a-5a和式2b-5b所示的結構)具有選擇性好、響應速度快、高穩定性等優點。本專利技術所述ne熒光探針是指檢測ne(去甲基腎上腺素)的近紅外熒光探針。
2、本專利技術提供了一系列的ne熒光探針(包括但不限于式2a-5a和式2b-5b所示的結構)，其結構如下式所示：
3、
4、其中，所述ne熒光探針3a-5a和2b-5b，隨ne濃度升高探針的熒光發射峰逐漸升高，而探針2a為比率型探針，隨ne濃度升高探針的熒光發射峰逐漸升高，在另外一個波長的發射峰保持不變，通過兩個發射峰的比值變化可以對ne進行定量分析等，與其他探針相比，本專利技術所述ne近紅外熒光探針選擇性好，生物相容性好，響應速度快、高的穩定性，并且其中探針2a具備定量分析能力，使檢測更準確，在生物傳感、成像等方面具有很大優勢。
5、本專利技術還提供了所述ne熒光探針的制備方法，包括以下步驟：
6、將含有取代基的苯硫醇和吡啶、三光氣進行第一反應得到液體，然后加入有機溶劑分別和化合物1a、1b進行第二反應，得到ne熒光探針。所述含有取代基的苯硫醇，包括但不限于對甲氧基苯硫醇、對叔丁基苯硫醇、對氟苯硫醇和對甲基苯硫醇。本專利技術制備得到的所述ne熒光探針包括但不限于如式2a-5a和式2b-5b所示的結構。
7、所述制備方法的反應過程如下反應式(a)所示：
8、其中，所述第一反應的溫度為-30℃～10℃；優選地，為0℃。
9、其中，所述第一反應的時間為30min-120min；優選地，為60min。
10、其中，所述第一反應優選地在氮氣氛圍下進行。
11、優選地，所述第一反應結束后，冷卻至室溫后進行萃取后加入化合物1a或1b進行過夜反應(第二反應)。
12、其中，所述第二反應的溫度為0℃-35℃；優選地，為35℃。
13、本專利技術中，所述第一反應是指含有取代基的苯硫醇和吡啶、三光氣進行反應；所述第二反應是指第一反應得到的產物和化合物1a、1b反應。
14、其中，所述有機溶劑選二氯甲烷、乙腈或n,n-二甲基甲酰胺dmf等中的一種或多種；優選地，為n,n-二甲基甲酰胺dmf。
15、
16、其中，所述第二反應的時間為5h-24h；優選地，為10h。
17、其中，含有取代基的苯硫醇、吡啶、三光氣、化合物1a或1b的摩爾比為5-100：5-100：5-100：1。優選地，為50：50：25：1。
18、在本專利技術的一個具體實施方式中，所述ne熒光探針的制備方法包括：
19、將含有取代基的苯硫醇(包括但不限于對甲氧基苯硫醇、對叔丁基苯硫醇、對氟苯硫醇或對甲基苯硫醇)(1mmol)、吡啶(1mmol)和三光氣(0.5mmol)與無水二氯甲烷(1ml)的混合物在氮氣保護條件下和0℃中攪拌1h。然后倒入100ml冰水中，將有機層分離，用水洗滌，用硫酸鈉干燥，減壓濃縮，粗產物直接用于進一步合成。將化合物1a或1b(0.1mmol)和三乙胺(0.2mmol)溶解在3mldmf中，加入上述粗產物，室溫和氮氣保護條件下攪拌10h。減壓蒸發除去溶劑，粗產物經硅膠柱層析純化，得到化合物2a-5a或2b-5b。
20、本專利技術還提供了一種如上所述方法制備得到的ne熒光探針2a-5a和2b-5b。
21、其中，所述ne熒光探針3a-5a和2b-5b，隨ne濃度升高探針的熒光發射峰逐漸升高(圖1)，而探針2a為比率型探針，隨ne濃度升高探針的熒光發射峰逐漸升高，在另外一個波長的發射峰保持不變，通過兩個發射峰的比值變化可以對ne進行定量分析等，與其他探針相比，本專利技術所述ne近紅外熒光探針選擇性好，生物相容性好，響應速度快、高的穩定性，并且其中探針2a具備定量分析能力，使檢測更準確，在生物傳感、成像等方面具有很大優勢。
22、本專利技術還提供了所述ne熒光探針在體外和/或細胞內和/或活體內檢測ne中的應用；通過單光子熒光檢測、實現對ne的檢測；其中，所述細胞包括但不限于神經元細胞等；所述活體不包括人。
23、本專利技術還提供了所述ne熒光探針在細胞成像與生物傳感中的應用。
24、由于ne熒光探針可以與ne反應形成一種新的熒光物質，導致探針熒光的恢復。因此，本專利技術還提供了一種體外ne的熒光檢測方法，所述方法包括以下步驟：在緩沖液中，將本專利技術所述ne熒光探針與ne混合搖勻進行反應，在激發波長650nm測定探針和新物質的熒光強度變化，從而實現對ne的定量檢測。
25、其中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，優選地，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mm，ph為7.4。
26、其中，所述反應的溫度為室溫。
27、其中，所述反應的時間為60-105ms；優選地，為105ms。
28、其中，所述方法的線性范圍為15nm-60μm；最低檢測限為3.2nm。
29、其中，單光子熒光強度比與ne濃度的線性關系為r2＝0.983。
30、其中，所述方法可應用于細胞、活體中。
31、在本專利技術的一個具體實施方式中，所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種NE熒光探針，其特征在于，其結構如下式2a-5a和2b-5b所示：
2.一種NE熒光探針的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反應的溫度為-30℃～10℃；
4.將如權利要求1所述的NE熒光探針在體外和/或細胞內檢測NE中的應用、在細胞成像與生物傳感中的應用。
5.一種體外NE的熒光檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：緩沖液混合溶液中，將如權利要求1所述的NE熒光探針與NE進行反應，然后用激發波長為650nm的波長激發，測定溶液的熒光強度。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，隨著加入NE含量的增加，所述NE熒光探針本身的熒光強度逐漸增加，其中探針2a的一個的發射峰的熒光強度幾乎不變，另一個發射峰熒光強度逐漸增加，呈比率型變化，有良好的線性，從而實現對NE的定量檢測。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；和/或，所述反應的溫度為室溫；和/或，所述反應的時間為60ms-105ms。
8.一
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的溫度為37℃；和/或，所述細胞與NE探針孵育的時間為10min-60min。
10.如權利要求1所述的NE熒光探針，其特征在于，其結構如下式2a-5a、式2b-5b所示：
...【技術特征摘要】
1.一種ne熒光探針，其特征在于，其結構如下式2a-5a和2b-5b所示：
2.一種ne熒光探針的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一反應的溫度為-30℃～10℃；
4.將如權利要求1所述的ne熒光探針在體外和/或細胞內檢測ne中的應用、在細胞成像與生物傳感中的應用。
5.一種體外ne的熒光檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：緩沖液混合溶液中，將如權利要求1所述的ne熒光探針與ne進行反應，然后用激發波長為650nm的波長激發，測定溶液的熒光強度。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，隨著加入ne含量的增加，所述ne熒光探針本身的熒光強度逐漸增加，其中探針2a的一個的發射峰的熒光強度幾乎不變，另一個發射峰熒光強度逐漸增加，呈...
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