【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人乳頭瘤病毒的疫苗制劑，尤其涉及九價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗制劑及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、人乳頭瘤病毒(human?papillomavirus,hpv)，是一種無(wú)包膜的小dna病毒，可感染人表皮和粘膜鱗狀上皮細(xì)胞。于1974年首次提出了hpv感染與宮頸癌的關(guān)系，并最終證明hpv感染是引起宮頸癌發(fā)生的主要病因。hpv感染是最常見(jiàn)的生殖道病毒感染，人感染hpv不僅有可能導(dǎo)致宮頸癌，還可能引起肛門生殖器癌和生殖器疣，此外，口咽癌和其他頭頸部癌、結(jié)腸癌、直腸癌的發(fā)生也與hpv感染相關(guān)。接種hpv疫苗是預(yù)防hpv持續(xù)感染和相關(guān)疾病發(fā)生的最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。
2、在疫苗制劑的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，保證蛋白的穩(wěn)定非常重要且極具挑戰(zhàn)性。這是因?yàn)椋鞍踪|(zhì)作為生物大分子，其穩(wěn)定性依賴于較復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)(二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及四級(jí)結(jié)構(gòu))的完整性，而這些高級(jí)結(jié)構(gòu)極易在蛋白純化、存儲(chǔ)及制劑生產(chǎn)中受到外界環(huán)境的干擾而遭到破壞。蛋白在遭受各種環(huán)境脅迫壓力(溫度、存儲(chǔ)時(shí)間、振動(dòng)、凍融、凍干)后，會(huì)發(fā)生一系列化學(xué)性的氨基酸殘基降解，如天冬酰胺的脫氨基、甲硫氨酸的氧化及肽鍵的水解等；此外，物理性的聚集或解聚也是蛋白生物制品面臨的挑戰(zhàn)之一，如部分結(jié)構(gòu)去折疊、蛋白聚集或吸附以及蛋白沉淀等。抗原蛋白的這類化學(xué)或物理性變化會(huì)導(dǎo)致該抗原的免疫原性的降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于現(xiàn)有技術(shù)的需求，本專利技術(shù)通過(guò)深入研究獲得涵蓋2種與生殖器疣明確相關(guān)，7種與宮頸癌明確相關(guān)型別(hpv6、11和hpv16
2、首先本專利技術(shù)提供的九價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗制劑，其包括hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58型的l1-vlp蛋白抗原，及佐劑；
3、其中hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58蛋白抗原用量重量比為(1～3):(1～5):(2～7):(1～5):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3):(0.5～3)：每0.5ml里每種蛋白用量為10～100μg，佐劑的用量為0.5～1.0mg；
4、其中各型的vlp蛋白在30～40℃下成熟化處理6～48h，得到成熟化的vlp蛋白，再用于制備所述疫苗制劑；且所述疫苗制劑采用組氨酸緩沖體系，并添加滲透壓調(diào)節(jié)劑和表面活性劑。
5、本專利技術(shù)人在研究中發(fā)現(xiàn)，使用組氨酸緩沖液體系，組氨酸體系易發(fā)生vlp的解聚，有部分未組裝的五聚體；通過(guò)將hpv?l1蛋白五聚體組裝后的人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒(vlp)在30～40℃下成熟化處理6～48h，優(yōu)選為在35～38℃下成熟化處理12～36h，更優(yōu)選為37℃下成熟化處理24h；提高了疫苗制劑的穩(wěn)定性和免疫原性。
6、優(yōu)選地，所述組氨酸緩沖體系的ph為5～7，更優(yōu)選ph為5.5～6.5；組氨酸濃度為5～20mm，優(yōu)選為10～15mm；氯化鈉濃度為300～600mm，更優(yōu)選為420～480mm；聚山梨酯80的濃度為0.005％～0.025％，優(yōu)選為0.01％～0.025％。
7、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、磷酸鈉或硫酸鈉的一種或多種；所述表面活性劑為聚山梨酯80；
8、優(yōu)選實(shí)施方式中，hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的l1-vlp蛋白抗原用量重量比為1.5:2:3:2:1:1:1:1:1；每0.5ml里，hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的l1-vlp蛋白抗原分別為30μg、40μg、60μg、40μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg；佐劑的用量為0.75mg。
9、更具體地，hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的l1-vlp蛋白抗原由大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)獲得。
10、在具體實(shí)施方式中，所述佐劑為鋁佐劑，優(yōu)選為氫氧化鋁佐劑。
11、另個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，各型l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～80nm，佐劑的粒徑為3～10μm；更優(yōu)選hpv6l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv11l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv16l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv18l1-vlp蛋白抗原的粒徑為55～75nm，hpv31l1-vlp蛋白抗原的粒徑為55～75nm，hpv33l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv45l1-vlp蛋白抗原的粒徑為50～65nm，hpv52l1-vlp蛋白抗原的粒徑為50～65nm，hpv58l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，佐劑的粒徑為5～8μm。
12、優(yōu)選地，所述各型l1-vlp蛋白抗原由各型l1五聚體蛋白與組裝液(ph4.5～5.5，nacl濃度2.0～5.0m)混合后組裝而成，l1五聚體蛋白的粒徑為10～15nm。
13、在具體的實(shí)施方式中，hpv6l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv11l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv16l1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，hpv18l1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，hpv31l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv33l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv45l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv52l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv58l1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm。
14、在具體的實(shí)施方式中，所述各型l1-vlp蛋白抗原中的l1蛋白序列在野生型序列的基礎(chǔ)有如下截短：野生型hpv6l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv11l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv16l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv18l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv31l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv33l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv45l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv52l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型hpv58l1的n端截短不多于10個(gè)氨基酸，c端截短不多于30個(gè)氨基酸。
15、優(yōu)選地，所述各型l1蛋白的氨基酸序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.3、seq?idno.5、seq?id?no.7、seq?id?no.9、seq?id?no.11、seq?id?no.13、seq?id?no.15、seq?idno.17所示。
16、本專利技術(shù)還提供所述的疫苗制劑的制備方法，其包括如下步驟：
17、取純化的各型hpv?l1蛋白經(jīng)體外自組裝形成vlp，vlp進(jìn)一步經(jīng)過(guò)柱層析換液及除菌過(guò)濾制備得vlp蛋本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.九價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗制劑，其包括HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58?型的L1-VLP蛋白抗原，及佐劑；
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其特征在于，所述組氨酸緩沖體系的pH為5～7，更優(yōu)選pH為5.5～6.5；組氨酸濃度為5～20mM，優(yōu)選為10～15mM；
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其特征在于，其中HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1-VLP蛋白抗原的用量重量比為1.5:2:3:2:1:1:1:1:1；每0.5ml?里，HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58的L1-VLP蛋白抗原分別為30μg、40μg、60μg、40μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg；佐劑的用量為0.75mg；
4.如權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其特征在于，各型L1-VLP蛋白抗原的粒徑為45～80nm，佐劑的粒徑為3～10μm；更優(yōu)選HPV6L1-VLP蛋白抗原的粒徑為45～60nm，HPV11L1-VLP蛋白抗原的粒徑為45～60nm，HPV16L1-VLP蛋白抗原的粒徑為45
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗制劑，其特征在于，所述各型L1-VLP蛋白抗原由各型L1五聚體蛋白組裝而成，L1五聚體蛋白的粒徑為10～15nm；更優(yōu)選HPV6L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV11L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV16L1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，HPV18L1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，HPV31L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV33L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV45L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV52L1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，HPV58L1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm。
6.如權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其特征在于，所述各型L1-VLP蛋白抗原中的L1蛋白序列在野生型序列的基礎(chǔ)有如下截短：野生型HPV6L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV11L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV16L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，?C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV18L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV31L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV33L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV45L1的?N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV52L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸；野生型HPV58L1的N端截短不多于10個(gè)氨基酸，C端截短不多于30個(gè)氨基酸。
7.如權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其特征在于，所述各型L1蛋白的氨基酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.9、SEQ?ID?NO.11、SEQID?NO.13、SEQ?ID?NO.15、SEQ?ID?NO.17所示。
8.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的疫苗制劑的制備方法，其包括如下步驟：
9.如權(quán)利要求8所述的九價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗制劑的制備方法，其特征在于，還包括成品灌裝，具體地啟動(dòng)預(yù)灌封注射器灌裝機(jī)進(jìn)行灌裝，優(yōu)選地，灌裝速度為30～40轉(zhuǎn)/min，更優(yōu)選地以0.55ml/支灌注分裝并加膠塞，于2～8℃冷庫(kù)中保存?zhèn)溆谩?/p>
10.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的疫苗制劑在制備預(yù)防或治療人乳頭瘤病毒所致疾病的藥物中的用途。
...【技術(shù)特征摘要】
1.九價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗制劑，其包括hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58?型的l1-vlp蛋白抗原，及佐劑；
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其特征在于，所述組氨酸緩沖體系的ph為5～7，更優(yōu)選ph為5.5～6.5；組氨酸濃度為5～20mm，優(yōu)選為10～15mm；
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其特征在于，其中hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的l1-vlp蛋白抗原的用量重量比為1.5:2:3:2:1:1:1:1:1；每0.5ml?里，hpv6、11、16、18、31、33、45、52、58的l1-vlp蛋白抗原分別為30μg、40μg、60μg、40μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg；佐劑的用量為0.75mg；
4.如權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其特征在于，各型l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～80nm，佐劑的粒徑為3～10μm；更優(yōu)選hpv6l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv11l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv16l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv18l1-vlp蛋白抗原的粒徑為55～75nm，hpv31l1-vlp蛋白抗原的粒徑為55～75nm，hpv33l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，hpv45l1-vlp蛋白抗原的粒徑為50～65nm，hpv52l1-vlp蛋白抗原的粒徑為50～65nm，hpv58l1-vlp蛋白抗原的粒徑為45～60nm，佐劑的粒徑為5～8μm。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗制劑，其特征在于，所述各型l1-vlp蛋白抗原由各型l1五聚體蛋白組裝而成，l1五聚體蛋白的粒徑為10～15nm；更優(yōu)選hpv6l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv11l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv16l1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，hpv18l1五聚體蛋白的粒徑為11～14nm，hpv31l1五聚體蛋白的粒徑為12～15nm，hpv33l1五...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉永江，高文雙，陳曉，銀飛，張瑞霞，王艷，伍樹(shù)明，張海江，姜緒林，劉玉瑩，于泓洋，高俊，楊秀芬，陳丹，仉春艷，張堯，楊增敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京康樂(lè)衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。