【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種快速制備目標(biāo)基因全外顯子區(qū)拷貝數(shù)變異的核酸參考品的方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、拷貝數(shù)變異(copy?number?variation，cnv)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的，一般指長度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)包括缺失、插入、重復(fù)、重排、倒位、dna拷貝數(shù)目變化等。cnv是造成個(gè)體差異的重要遺傳基礎(chǔ)，它在人類基因組中分布廣泛，其覆蓋的核苷酸總數(shù)大大超過單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotidepolymorphisms，snps)的總數(shù)，極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性。研究表明大部分cnv與復(fù)雜疾病密切相關(guān)。cnv如果發(fā)生在腫瘤相關(guān)基因序列內(nèi)部或周圍可能引起癌基因激活、抑癌基因失活，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。cnv通過改變基因劑量、調(diào)節(jié)基因活性影響基因表達(dá)、表型差異和表型適應(yīng)，從而引起腫瘤以及其他遺傳疾病。比如人類met基因全長編碼的met蛋白是潛在的靶向致癌驅(qū)動(dòng)因子，met基因擴(kuò)增導(dǎo)致met基因拷貝數(shù)增加，是egfr-tkis抑制劑獲得性耐藥的機(jī)制之一，影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后；人類表皮生長因子受體2(her2)基因擴(kuò)增使腫瘤細(xì)胞表面her2蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致her2主導(dǎo)的生長信號(hào)通路過度活躍，引起腫瘤細(xì)胞惡性分化，her2基因拷貝數(shù)是乳腺癌和胃靶向治療預(yù)后評(píng)估的至關(guān)重要指標(biāo)；表皮生長因子受體(epidermalgrowth?factor?receptor，egfr)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用，egfr基因擴(kuò)增引起egfr基因過度表達(dá)，可能誘導(dǎo)正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)
2、傳統(tǒng)檢測基因cnv的方法包括熒光原位雜交(fish)、多重連接依賴探針擴(kuò)增(mlpa)、熒光定量pcr(qpcr)、數(shù)字pcr(ddpcr)等。除此之外，基于高通量測序(nextgenerationsequencing，ngs)的檢測基因cnv的方法如全基因組測序(wgs)、全外顯子測序(wes)和靶向測序(target-ngs)也得到廣泛的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)根據(jù)目的基因組序列，設(shè)計(jì)了可覆蓋全部外顯子區(qū)域的長片段擴(kuò)增引物，通過pcr方法獲得覆蓋目的基因全部外顯子區(qū)多個(gè)dna片段，并按照預(yù)期拷貝數(shù)與人類正常細(xì)胞系基因組dna進(jìn)行混摻，從而制備預(yù)期拷貝數(shù)變異梯度的核酸參考品。
2、本專利技術(shù)制備的拷貝數(shù)變異核酸參考品背景基因組單一、檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠、制備方法簡單、周期短，適用基于靶向捕獲測序檢測基因拷貝數(shù)變異的實(shí)驗(yàn)流程質(zhì)控和性能確認(rèn)。
3、具體地，本專利技術(shù)提供了以下技術(shù)方案：
4、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種制備拷貝數(shù)參考品的方法，所述方法包括以下步驟：
5、1)獲得一個(gè)或多個(gè)核酸片段，當(dāng)核酸片段為多個(gè)時(shí)，按照相同拷貝數(shù)將所述多個(gè)核酸片段混合獲得混合物，所述核酸片段的序列位于基因組的外顯子區(qū)域；
6、2)根據(jù)以下公式將1)所述一個(gè)或多個(gè)核酸片段與基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品混合獲得預(yù)期cnv的參考品：
7、加入核酸片段混池的拷貝數(shù)＝(預(yù)期cnv-2)×基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)/2。
8、優(yōu)選地，預(yù)期cnv大于2。
9、優(yōu)選地，所述參考品具有特定的拷貝數(shù)，可以任意設(shè)置，如預(yù)期cnv可以是2、2.1、2.2、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。本專利技術(shù)具體實(shí)施例中以預(yù)期cnv＝5和預(yù)期cnv＝8為示例進(jìn)行制備。
10、優(yōu)選地，所述多個(gè)核酸片段之間有，或，沒有重疊區(qū)域。
11、優(yōu)選地，所述多個(gè)核酸片段之間沒有重疊區(qū)域。
12、優(yōu)選地，所述核酸片段長度大于2500bp。
13、優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過人工打斷的。
14、優(yōu)選地，所述人工打斷的方法包括超聲處理、機(jī)械打斷或酶切。
15、優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過超聲處理的。
16、優(yōu)選地，所述超聲處理具體可以使用功率5-15w進(jìn)行處理；優(yōu)選地，10w。
17、優(yōu)選地，所述超聲處理進(jìn)行10-30秒；優(yōu)選地，15-25秒；最優(yōu)選地，20秒。
18、優(yōu)選地，所述超聲處理的參數(shù)是10w處理20秒。
19、優(yōu)選地，所述超聲處理的基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品的片段長度與1)中核酸片段長度相近。
20、優(yōu)選地，所述超聲處理的基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品的主峰在3～20kb、5-15kb、或8-12kb之間，具體包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20kb的范圍內(nèi)，具體主峰位置可以如圖8所示例的。
21、優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品可以是任意生物的基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品，例如真核生物、原核生物、病毒；更具體地例如，動(dòng)物：鼠、猴、牛、羊、豬、馬、雞等；植物：擬南芥、馬鈴薯、甘薯、紫薯、山藥、芋類、木薯、菊薯、水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等；病毒：腺病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、ⅰ型單純皰疹病毒(hsv-ⅰ)、ⅱ型單純皰疹病毒(hsv-ⅱ)、牛瘟病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、海膽病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、腮腺炎病毒、新型冠狀病毒等。
22、優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是動(dòng)物的基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品。
23、更優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是人類基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品。
24、更優(yōu)選地，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是人類正常b淋巴細(xì)胞系基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品na24385。本專利技術(shù)具體實(shí)施例中，制備參考品時(shí)所加入的1μg?na24385的拷貝數(shù)為3.04×105。
25、優(yōu)選地，所述外顯子區(qū)域可以是任意生物的基因組外顯子區(qū)域，例如真核生物、原核生物、病毒，更具體地例如，動(dòng)物：鼠、猴、牛、羊、豬、馬、雞等；植物：擬南芥、馬鈴薯、甘薯、紫薯、山藥、芋類、木薯、菊薯、水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等；病毒：腺病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、ⅰ型單純皰疹病毒(hsv-ⅰ)、ⅱ型單純皰疹病毒(hsv-ⅱ)、牛瘟病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、海膽病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、腮腺炎病毒、新型冠狀病毒等。
26、優(yōu)選地，所述外顯子區(qū)域是動(dòng)物基因組的外顯子區(qū)域。
27、優(yōu)選地，所述外顯子區(qū)域是人類基因組的外顯子區(qū)域。
28、優(yōu)選地，所述外顯子區(qū)域是一個(gè)或多個(gè)目的基因的外顯子區(qū)域。
29、優(yōu)選地，所述目的基因包括以下任意一種或多種：akt1、alk、ar、araf、braf、brca1、brca2、cdk4、ctnnb1、ddr2、egfr、erbb2、erbb3、errfi1、esr1、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、flt1、gna11、gnaq、hras、idh1、idh2、kit、kras、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種制備拷貝數(shù)參考品的方法，所述方法包括以下步驟：
2.權(quán)利要求1所述方法，所述基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過人工打斷的；
3.權(quán)利要求1所述方法，所述基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品的來源包括以下任意一種生物：真核生物、原核生物、病毒；
4.權(quán)利要求1所述方法，所述外顯子區(qū)域包括于以下任意一種生物的基因組外顯子區(qū)域：真核生物、原核生物、病毒；
5.權(quán)利要求4所述方法，所述目的基因包括以下任意一種或多種：AKT1、ALK、AR、ARAF、BRAF、BRCA1、BRCA2、CDK4、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERRFI1、ESR1、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT1、GNA11、GNAQ、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAPK?1、MET、MTOR、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RAC1、RB1、RET、RICTOR、ROS1、SMAD4、TERT、TP53、TSC1、VEGFA、A
6.權(quán)利要求5所述方法，所述外顯子區(qū)域是MET基因的外顯子區(qū)域，所述核酸片段有多個(gè)，且所述多個(gè)核酸片段可以覆蓋MET基因的外顯子區(qū)域；
7.權(quán)利要求5所述方法，所述目的基因是HER2、MET、EGFR、TP53和MYC，所述核酸片段覆蓋HER2、MET、EGFR、TP53和MYC基因的外顯子區(qū)域；
8.權(quán)利要求1所述方法所制備的參考品或包含所述參考品的產(chǎn)品；
9.一種檢測拷貝數(shù)檢測方法準(zhǔn)確性的方法，所述方法包括對(duì)權(quán)利要求8所述參考品的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果與預(yù)期CNV進(jìn)行比較；
10.權(quán)利要求8參考品在監(jiān)測拷貝數(shù)檢測方法結(jié)果準(zhǔn)確性中的應(yīng)用；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備拷貝數(shù)參考品的方法，所述方法包括以下步驟：
2.權(quán)利要求1所述方法，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)過人工打斷的；
3.權(quán)利要求1所述方法，所述基因組dna標(biāo)準(zhǔn)品的來源包括以下任意一種生物：真核生物、原核生物、病毒；
4.權(quán)利要求1所述方法，所述外顯子區(qū)域包括于以下任意一種生物的基因組外顯子區(qū)域：真核生物、原核生物、病毒；
5.權(quán)利要求4所述方法，所述目的基因包括以下任意一種或多種：akt1、alk、ar、araf、braf、brca1、brca2、cdk4、ctnnb1、ddr2、egfr、erbb2、erbb3、errfi1、esr1、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、flt1、gna11、gnaq、hras、idh1、idh2、kit、kras、map2k1、mapk?1、met、mtor、nf1、nf2、notch1、nras、ntrk1、ntrk2、ntrk3、pdgfra、pik3ca、pten、rac1、rb1、ret、rictor、ros1、smad4...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周龍溪，鄧濤，朱修篁，王真，翟兵兵，馬琳，孫立超，
申請(專利權(quán))人：北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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