【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物檢測，具體涉及一種用于檢測間充質干細胞污染的通用引物及其檢測方法。
技術介紹
1、間充質干細胞及其外泌體在臨床醫學方面具有廣闊的應用前景，因此，間充質干細胞的無污染培養越來越受到人們的重視。間充質干細胞培養過程，需要符合嚴格的質控檢測。質控檢測包括無菌性、致瘤性、細胞純度、細胞活性。其中無菌性包括支原體、細菌、真菌和內毒素的的檢測。
2、傳統的支原體檢測方法主要有培養法和指示細胞法，一般要求同時進行檢測。這兩種方法通常需要較長時間，如培養法至少28天。近年來，細胞治療藥物快速發展，且其上市周期快，貨架期短，培養法和指示細胞法均無法滿足藥物放行的時間要求。實時熒光定量pcr是一種通過對待測樣品中的特定dna序列進行定量分析的方法。實時熒光定量pcr是在pcr擴增過程中，通過熒光信號，對pcr進程進行實時檢測。由于在pcr擴增的指數時期，模板的ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。pcr產物熔解曲線圖的單一峰圖表明pcr擴增產物的單一性。因此基于實時熒光定量pcr技術檢測支原體預期能夠取得良好的檢測效果。然而，間充質干細胞在培養過程中也容易受細菌和真菌的污染，盡管目前已有檢測細菌和/或真菌的特異性片段和通用引物的報道，但目前還未有同時能夠用于間充質干細胞培養過程細菌、真菌和支原體污染的通用檢測引物和方法。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種用于檢測間充質干細胞污染的通用引物，能夠實現細菌、真菌和支原體的同時檢測
2、本專利技術的目的還在于提供了一種用于檢測細菌、真菌和支原體的通用引物，不僅可以針對中國藥典涉及的若干種典型支原體，還能對多種細菌和真菌進行檢測，快速、特異性檢測間充質干細胞制劑中是否存在細胞、真菌、支原體的污染，簡化實驗操作，降低檢測成本。
3、本專利技術提供了一種用于檢測細菌、真菌和支原體的dna特異性片段，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的dna片段或在seq?id?no:1的基礎上截取長度50％以上的dna片段。
4、優選的，包括核苷酸序列如seq?id?no:2或seq?id?no:3所示的dna片段。
5、本專利技術提供了一種基于熒光定量pcr技術檢測間充質干細胞污染的通用引物，包括核苷酸序列如seq?id?no：4所示的正向引物f1和核苷酸序列如seq?id?no：5所示的反向引物r1以及核苷酸序列如seq?id?no：6所示的正向引物f2和核苷酸序列如seq?id?no：7所示的反向引物r2。
6、本專利技術提供了一種基于熒光定量pcr技術檢測間充質干細胞污染的試劑盒，包括所述通用引物和熒光定量pcr擴增用預混液。
7、優選的，所述熒光定量pcr擴增用預混液包括master?qpcrmix(+udg)。
8、本專利技術提供了所述通用引物在制備檢測間充質干細胞污染的試劑盒中的應用。
9、本專利技術提供了一種檢測間充干細胞培養體系中細菌、真菌和支原體污染的方法，包括以下步驟：
10、從待測間充干細胞培養體系中提取dna；
11、以提取的dna為模板，利用所述通用引物配制qpcr反應體系，進行qpcr擴增；
12、根據擴增曲線的形狀和檢測通道ct值判斷待測間充干細胞培養體系中是否存在細菌、真菌和支原體污染：
13、陽性：檢測通道ct值<29，且擴增曲線有明顯的指數增長趨勢；
14、陰性：樣本檢測結果ct≥30或無ct值且無明顯指數增長趨勢的擴增曲線；
15、可疑：29≤ct值＜30，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現ct值<29和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
16、優選的，所述qpcr反應體系以10μl計，包括masterqpcr?mix-sybr(+udg)5μl、10μm正向引物0.5μl、10μm反向引物0.5μl和dna4μl。
17、優選的，所述qpcr擴增的反應體系為50℃2min；95℃2min；95℃15s，55℃30s，72℃30s，32個循環，72℃采集熒光信號。
18、優選的，所述細菌包括以下至少一種：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌；
19、所述真菌包括白色念珠菌和/或黑曲霉；
20、所述支原體包括口腔支原體和/或肺炎支原體。
21、本專利技術提供了一種用于檢測細菌、真菌和支原體的dna特異性片段，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的dna片段。本專利技術首先對7種細菌真菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)和2種支原體(口腔支原體和肺炎支原體)的全基因組進行序列比對，找到一段同源保守序列，然后根據該同源保守序列設計擴增引物，利用所述引物進行熒光定量pcr檢測驗證，可實現細菌、真菌和支原體的檢測，大大簡化了檢測操作，為同時檢測細菌、真菌和支原體提供了基礎。
22、本專利技術提供了一種基于熒光定量pcr技術檢測間充質干細胞污染的通用引物，包括核苷酸序列如seq?id?no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no：4所示的反向引物。利用本專利技術提供的通用引物能快速、特異性檢測間充質干細胞制劑中是否存在細菌真菌和支原體污染。本專利技術實施例通過實時熒光定量pcr方法，以藥典記載的7種細菌真菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉)和2種支原體(口腔支原體和肺炎支原體)作為代表，以其滅活的dna為模板進行實時熒光定量pcr反應，結果表明所述通用引物能夠同時檢測細菌、真菌和支原體，而且具有良好的檢測特異性，同時檢測靈敏度高于中國藥典記載的傳統培養法靈敏度。所述通用引物的開發為快速高效檢測細菌、真菌和支原體的應用環境提供了極大便利，并且能大大降低檢測成本，降低勞動力投入。
23、本專利技術提供了一種檢測間充干細胞培養體系中細菌、真菌和支原體污染的方法，通過實時熒光定量pcr方法利用擴增曲線的形狀和檢測通道ct值判斷待測間充干細胞培養體系中是否存在細菌、真菌和支原體污染。本專利技術提供的方法滿足快速高效的檢測要求，大大簡化間充干細胞培養體系污染微生物的檢測步驟，有極大的工業推廣應用價值。
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1.一種用于檢測細菌、真菌和支原體的DNA特異性片段，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的DNA片段或在SEQ?ID?NO:1的基礎上截取長度50％以上的DNA片段。
2.根據權利要求1所述用于檢測細菌、真菌和支原體的DNA特異性片段，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:3所示的DNA片段。
3.一種基于熒光定量PCR技術檢測間充質干細胞污染的通用引物，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示的正向引物F1和核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示的反向引物R1以及核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6所示的正向引物F2和核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7所示的反向引物R2。
4.一種基于熒光定量PCR技術檢測間充質干細胞污染的試劑盒，其特征在于，包括權利要求3所述通用引物和熒光定量PCR擴增用預混液。
5.根據權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR擴增用預混液包括MasterqPCR?Mix(+UDG)。
6.權利要求3所述通用引物在制備檢測
7.一種檢測間充干細胞培養體系中細菌、真菌和支原體污染的方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述qPCR反應體系以10μl計，包括Master?qPCR?Mix-SYBR(+UDG)5μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL和DNA4μL。
9.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述qPCR擴增的反應體系為50℃2min；95℃2min；95℃15S，55℃30S，72℃30S，32個循環，72℃采集熒光信號。
10.根據權利要求7～9中任意一項所述方法，其特征在于，所述細菌包括以下至少一種：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌；
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測細菌、真菌和支原體的dna特異性片段，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no:1所示的dna片段或在seq?id?no:1的基礎上截取長度50％以上的dna片段。
2.根據權利要求1所述用于檢測細菌、真菌和支原體的dna特異性片段，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no:2或seq?id?no:3所示的dna片段。
3.一種基于熒光定量pcr技術檢測間充質干細胞污染的通用引物，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no：4所示的正向引物f1和核苷酸序列如seq?id?no：5所示的反向引物r1以及核苷酸序列如seq?id?no：6所示的正向引物f2和核苷酸序列如seq?id?no：7所示的反向引物r2。
4.一種基于熒光定量pcr技術檢測間充質干細胞污染的試劑盒，其特征在于，包括權利要求3所述通用引物和熒光定量pcr擴增用預混液。
5.根據權利要求4所述試劑...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊文琦，蔣雨薇，李世平，楊玉奇，陳文杰，華江舟，
申請(專利權)人：長沙干細胞與再生醫學工業技術研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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