一種制備尿激酶的方法，其特征在于采用了Ｄ１６０陽離子樹脂交換法、親和膜色譜法及親和層析法相結合，以尿激酶粗品為原料制備尿激酶。所得到的尿激酶質量優于現有國內水平，尿激酶比活可達到１５０，０００ＩＵ／ｍｇ．ｐｒ以上，高分子尿激酶相對含量可達到９６％以上，尿激酶生物活性回收率可達到６５％。本方法解決了現有尿激酶制備方法普遍存在的操作繁瑣、產品質量差，收率低和生產成本高等問題。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，尤其涉及一種親和膜色譜技術和親和層析技術制備尿激酶的方法。
技術介紹
尿激酶，簡稱區，是人體腎細胞產生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，絲氨酸和組氨酸是 酶活性中心的必需氨基酸。其主要存在于人及哺乳動物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然 高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)兩種，高分子量尿激酶溶解血 栓的臨床效果比低分子量的尿激酶約高3倍，國際上把尿激酶的相對分子量作為質量標準 的重要指標之一。臨床上主要用于治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓 性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網膜中央靜脈血栓形成。 尿激酶制備方法目前主要有離子交換層析法，凝膠分子篩法、免疫親和層析和對 氨基苯甲脒-S印harose親和層析等。如陳祥勝等報道了采用苯甲脒瓊脂糖凝膠親和層析 從尿激酶粗品中精制尿激酶，比活27938IU/mg 'pr，活性回收率62. 96%，純化倍數4. 03倍； 祝一鋒等報道了采用S印hadexG-50凝膠過濾、CM-S印hadex C-50、硫酸銨沉淀以及Bio-Gel P-30凝膠過濾等制備尿激酶精品，比活34080IU/mg pr，活性回收率60%左右，純化倍數 50倍。沈金玉等報道了采用免疫親和層析從尿激酶粗品精制尿激酶。離子交換和凝膠過濾 純化效率低下，難以獲得高純度的尿激酶精品；免疫親和層析純化尿激酶可獲得較高純度 的尿激酶精品，但由于免疫親和層析需使用生物配基，價格昂貴，很難獲得工業化生產使用 的配基；對氨基苯甲脒-S印harose作為一種較好的尿激酶精品精制方法，但也必須同其他 方法一起使用，而且必須在提取過程中多次使用才能獲得高質量的尿激酶，多次使用造成 生產成本極高、收率低，生產周期長。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種以尿激酶粗品為原料制備尿激酶的方法，該方法生產工 藝時間短，易于工業化生產，產品質量高，生產成本低。 本專利技術是這樣來實現的，首先尿激酶粗品經溶解、離心或過濾，體積較大時超濾濃 縮等步驟獲得的澄清溶液，調電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率 一致，再上裝有D160陽離子樹脂層析柱吸附，再洗滌、洗脫，得到的洗脫液上親和膜純化 柱，經洗滌、洗脫得到的洗脫液上親和層析柱，經洗滌、洗脫、過濾得到的濾液進行冷凍干 燥，最后得到尿激酶。其具體制備方法如下 (1)取一定量的尿激酶粗品(生物效價30000 50000IU/g，比活300 600IU/ g *pr)，用8 10倍尿激酶粗品量(體積與重量比)的p朋.0， 0. lmol/L磷酸緩沖液分2 3次加入溶解，每次攪拌溶解0. 5 1. 0小時，然后離心或過濾，合并上清或濾液，體積較大 時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用； (2)將步驟(1)得到的澄清溶液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液平衡的D160陽離子樹脂層析柱，然后用含0. 15 0. 30mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌；最后用PH10， 1 3%氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰； (3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然后上親和膜純化柱，用含0. 45 0. 60mol/L氯化鈉的pH7. 2， 0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 25 0. 35mo1/L氯化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰； (4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然后上親和層析柱，用含1. 0 2. 0mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 35 0. 45mol/L氯化鈉的pH3. 5 4. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，最后進行冷凍干燥，得到尿激酶。 本專利技術利用D160陽離子樹脂吸附法，親和膜色譜法與親和層析法等結合使用，以 尿激酶粗品為原料制備尿激酶，所得到的尿激酶質量優于現有國內水平，尿激酶比活可達 到150， 000IU/mg pr以上，高分子尿激酶相對含量可達到96%以上，尿激酶生物活性回收 率可達到65% 。本方法解決了現有尿激酶制備方法普遍存在的操作繁瑣、產品質量差，收率 低和生產成本高等問題。具體實施方式 實施例l: (1)取100g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液400ml溶解，攪拌50分 鐘，離心，沉淀再用P朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液400ml溶解，攪拌30分鐘，離心，合并兩次 上清，得到820ml澄清溶液，取樣檢測，總生物效價0. 042億單位； (2)將步驟(1)得到的820ml澄清溶液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析 柱使用的平衡液電導率一致，再上用含O. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩沖液平 衡的D160陽離子樹脂層析柱，然后用含0. 15mol/L氯化鈉的pH6. O，O. lmol/L磷酸緩沖液 洗滌；最后用PHIO， 1 %氨水進行洗脫，收集得到190ml洗脫活性峰，總生物效價0. 039億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的190ml洗脫活性峰用醋酸調pH7. 2，然后上親和膜純化 柱，用含0. 45mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 25mol/L氯化鈉 的pH3. 5，0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集得到90ml洗脫活性峰，總生物效價0. 035億單 位； (4)將步驟(3)收集得到的90ml洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然后上親和層析柱， 用含1. Omol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lmol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0. 35mol/L氯化鈉的 pH3. 5， 0. lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，得到85ml濾液，進行冷凍干燥， 得到34. lmg尿激酶，總生物效價O. 028億單位，比活167000IU/mg. pr，高分子尿激酶相對含 量97. 0 % ，活性總回收率66. 7 % 。 實施例2: (1)取200g尿激酶粗品，用p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液1000ml溶解，攪拌60分 鐘，離心，沉淀再用P朋.0， 0. lmol/L磷酸緩沖液1000ml溶解，攪拌30分鐘，過濾，合并兩次 上清，超濾濃縮，得到320ml濃縮液，取樣檢測，總生物效價0. 080億單位； (2)將步驟(1)得到的320ml濃縮液調節電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱 使用的平衡液電導率一致，再上用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.O，O. lmol/L磷酸緩沖液平 衡的D160陽離子樹脂層析柱，然后用含0. 20mol/L氯化鈉的p朋.0，0. lmol/L磷酸緩沖液 洗滌；最后用PH10， 2 %氨水進行洗脫，收集得到260ml洗脫活性峰，總生物效價0. 074億單 位； (3)將步驟(2)收集得到的260ml洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然后上親和膜純化 柱，用含0. 50mol/L氯化鈉的pH7. 2，0. lm本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備尿激酶的方法，其特征在于該方法依次包括如下步驟：（１）取一定量的尿激酶粗品，用８～１０倍尿激酶粗品量的ｐＨ６．０，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液分２～３次加入溶解，每次攪拌溶解０．５～１．０小時，然后離心或過濾，合并上清或濾液，體積較大時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用；（２）將步驟（１）得到的澄清溶液調電導率，使其與Ｄ１６０陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含０．１５～０．３０ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ６．０，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液平衡的Ｄ１６０陽離子樹脂層析柱，然后用含０．１５～０．３０ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ６．０，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液洗滌；最后用ｐＨ１０，１～３％氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰；（３）將步驟（２）收集得到的洗脫活性峰用醋酸調ｐＨ７．２，然后上親和膜純化柱，用含０．４５～０．６０ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液洗滌，再用含０．２５～０．３５ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ３．５～４．５，０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰；（４）將步驟（３）收集得到的洗脫活性峰用醋酸調ｐＨ７．２，然后上親和層析柱，用含１．０～２．０ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ７．２，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液洗滌，再用含０．３５～０．４５ｍｏｌ／Ｌ氯化鈉的ｐＨ３．５～４．５，０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，最后進行冷凍干燥，得到尿激酶。...
【技術特征摘要】
一種制備尿激酶的方法，其特征在于該方法依次包括如下步驟(1)取一定量的尿激酶粗品，用8～10倍尿激酶粗品量的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液分2～3次加入溶解，每次攪拌溶解0.5～1.0小時，然后離心或過濾，合并上清或濾液，體積較大時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用；(2)將步驟(1)得到的澄清溶液調電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液平衡的D160陽離子樹脂層析柱，然后用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌；最后用pH10，1～3％氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰；(3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調pH7.2，然后上親和膜純化柱，用含0.45～0.60m...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張志武，劉蘭花，曾英，朱月華，楊益輝，
申請(專利權)人：南昌市萬華生化藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：36[中國|江西]
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