本發明專利技術提供了五價重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其中活性成分包括重組ＨＰＶ的Ｌ１蛋白五聚體，所述ＨＰＶ型為ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３。該疫苗能夠預防９５％的尖銳濕疣和７５％的子宮頸癌。本發明專利技術所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，防治范圍更大。
Pentavalent recombinant human papillomavirus vaccine
The present invention provides pentavalent recombinant human papillomavirus vaccine, which comprises an active ingredient and adjuvant, pharmaceutically acceptable excipient and stabilizer, wherein the active ingredients include recombinant HPV L1 protein five precursor, the HPV type is HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33. The vaccine could prevent 95% of condyloma acuminata and 75% of cervical cancer. Compared with the existing vaccine, the vaccine of the invention has the advantages of stable quality, low cost and wide control range.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及人乳頭瘤病毒感染的預防和治療領域。具體地，本專利技術涉及五價(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33)重組人乳頭瘤病毒聯合疫苗及其應用。背暴按術子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國 際衛生組織資料)，成為世界范圍內僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二 號殺手?？茖W研究證實，導致宮頸陴的罪魁禍首是一種名為人乳頭瘤病毒 (Human Papill(MMvirus，簡稱H+V)的DNA致癌病毒。該病毒主要通過兩 性接觸傳染，專性侵染人體上皮細l胞特別是生殖器官，部分病毒攜帶者在反 復感染后表現出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宮頸細胞學異常，發展成I - III的宮頸內皮細胞 瘤樣變(CIN I-III )和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發展成致命的子宮頸癌。 部分低危險型(HPV6、 HPV11)病毒感染可導致男女兩性生殖器官部位的尖銳 濕疣。最新研究表明HPV除了直接導致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口腔癌和皮膚癌有重大關系。根據國際衛生組織冊O的有關資料，除了導致官 頸癌，HPV感染還可能解釋60。/。的皮膚癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人類重大癌癥。HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、 HPV18等 13種高危險型確認能夠導致宮頸癌癥。HPV6、 HPV11等低危險型是造成男女 生殖部位尖銳濕疣的關鍵病原體。為獲得良好的療效，能同時預防多種HPV 型感染的多價疫苗成為發展方向。
技術實現思路
3(一) 要解決的技術問題本專利技術的目的之一是提供五價(HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33)重組人乳頭瘤病毒聯合疫苗；本專利技術的另一目的是提供該重組人乳頭瘤病毒疫苗在制備藥物中的應用。(二) 技術方案本專利技術所述的五價重組人乳頭瘤病毒聯合疫苗，它包括活性成分以及佐 劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組 HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和 HPV33。所述輔料中的佐劑包括鋁鹽、3-0-去?；瘑瘟姿犷愔?3D-MPL)、脂質A衍生物。所述輔料中的賦型劑包括生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑。所述輔料中的穩定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液。所述HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的Ll蛋白五聚體含量 均為20-50yg/支疫苗。本專利技術所述的疫苗還可包括HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的L2蛋白、其它能與HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33蛋白五聚 體結合的蛋白，例如HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的E6/E7蛋 白。一種生產所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1) 表達、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33的L1蛋白五聚體；(2) 將所得L1蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到五價重組人乳頭瘤病 毒疫苗。其中，表達、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 的Ll蛋白五聚體的具體方法參見專利PCT/CN2008/000314 、 CN200810055700.5，得到純度均為95%以上的Ll蛋白五聚體。4本專利技術公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33引起的感染和疾病的藥物中的應用。本專利技術還公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由于抗體交叉反應 而由HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33以外的其它一種或多種HPV 型引起的感染和疾病的藥物中的應用。前述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直 腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。優選地，所述的感染和疾病是尖銳濕疣和子宮頸癌。本專利技術所述的疫苗可釆用多種方法作用于人體，包括肌肉和皮下注射。該疫苗在能引發對L1蛋白免疫反應的有效劑量范圍內使用。用于增強免疫反應的復合物的特定劑量依照Ll復合物不同而變化。 一般而言，Ll五聚體的用量在l-5pg/Kg體重之間。上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。例如，具體的劑量會根據是否伴隨有其他藥物劑量而定，或取決于個人的藥代動力學、藥物積累和代謝速率。 (三)有益效果本專利技術所述的疫苗能夠預防95 %的尖銳濕疣和75 %的子宮頸癌。該疫苗 的活性成分為HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33L1蛋白的五聚體,該五 聚體與HPV Ll蛋白的VLP (類病毒顆粒，為HPV Ll蛋白的七十二聚體)具 有相同的免疫原性和抗原性，且相對于VLP而言具有結構更穩定、工業成本 大幅降低的優點。本專利技術所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成 本低廉，防治范圍更大。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例l五價重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。一、HPV6 Ll五聚體的制備1、 克隆HPV6 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。2、 修飾HPV6L1衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達將含有堿基替代 突變的載有HPV6 Ll基因插入片段的表達質粒pGEX - 6-l通過熱激法導入大腸 桿菌BL21細胞之后，使用LB培養基(配方見《分子克隆》第三版，科學出版 社，2002年8月出版)進行攝氏37度培養，菌種接入后生長12小時開始用表達 誘導劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導，9小時后收獲細胞，細胞用Niro Soavi NS2006型高壓勻質機在800bar下重復破碎細胞2次，顯微鏡檢査細胞破 碎率達到90%以上。3、 HPV6L1蛋白五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經親和色譜 純化蛋白預裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產的Glutathione S印harose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4 B勻漿 放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床體積的 緩沖液A(組分為50mmol/LTric-HCl， 200畫1/L NaCl， lmmol/L EDTA ， pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室溫下作用 20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電鏡觀察純 化產物，得到HPV6 Ll的五聚體。二、 釆用與前述相同的方法制備HPVll、 HPV16、 HPV18和HPV33 Ll蛋白 的五聚體。三、 活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mMNaCl 的標準磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffe本文檔來自技高網...
【技術保護點】
五價重組人乳頭瘤病毒聯合疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組ＨＰＶ的Ｌ１蛋白五聚體，所述ＨＰＶ型為ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８和ＨＰＶ３３。
【技術特征摘要】
1、五價重組人乳頭瘤病毒聯合疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組HPV的L1蛋白五聚體，所述HPV型為HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV33。2、 根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的佐劑包括 鋁鹽、3D-MPL、脂質A衍生物。3、 根據權利要求l所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的穩定劑包括基 于磷酸鹽的生理緩沖液。4、 根據權利要求l所述的疫苗，其特征在于所述重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18、 HPV33的Ll蛋白五聚體含量均為20 - 50 u g/支疫苗。5、 一種生產如權利要求1-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1) 表達、分離、純化重組HPV6、 HPVll、 HPV16、 HPV18...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬潤林，陳小江，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]
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