【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種等溫?cái)U(kuò)增偶聯(lián)fes2納米酶的試紙條及其用途。具體而言，本專利技術(shù)涉及一種結(jié)合了等溫?cái)U(kuò)增如rpa和fes2納米酶的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)簡(jiǎn)易條件下實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，并通過(guò)fes2納米酶的高過(guò)氧化物酶樣活性增強(qiáng)比色信號(hào)而實(shí)現(xiàn)病原微生物核酸的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的試紙條及其用途。
技術(shù)介紹
1、由sars-cov-2引起的2019年冠狀病毒病(covid-19)已于2020年3月11日被世界衛(wèi)生組織宣布為全球大流行病，并持續(xù)了兩年半，對(duì)人們的生活、健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了巨大影響，對(duì)人類健康和全球經(jīng)濟(jì)構(gòu)成前所未有的威脅(guan?et?al.2020；wang?et?al.2020；zhu?et?al.2020)。盡管目前的疫苗接種率已大大提高，但sars-cov-2突變體可能會(huì)削弱已開(kāi)發(fā)抗體的保護(hù)功效，尤其是omicron突變體(cameroni?et?al.2022；iketani?etal.2022；li?et?al.2020)。此外，有效的藥物仍然不足，特別是對(duì)于重癥患者。因此，對(duì)病毒進(jìn)行可靠且響應(yīng)迅速的檢測(cè)對(duì)于預(yù)防covid-19等疾病的傳播至關(guān)重要，大規(guī)模篩查以識(shí)別陽(yáng)性患者并及時(shí)隔離在對(duì)抗這一流行病中仍然發(fā)揮著巨大作用。目前，基于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)的核酸檢測(cè)是全球靈敏檢測(cè)sars-cov-2的主要技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗瓤乖涂贵w檢測(cè)具有更高的靈敏度和特異性(hogan?et?al.2020；shih?et?al.2020；wagoneret?al.2020)。然而，rt-pcr具有各種局限性，例如過(guò)于耗時(shí)，并且需
2、與需要精確控制退火、變性和延伸溫度的rt-pcr相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在近幾十年來(lái)引起了很多關(guān)注，因?yàn)樗鼮楝F(xiàn)場(chǎng)設(shè)計(jì)快速便攜的分子檢測(cè)提供了絕佳的機(jī)會(huì)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多基于等溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)(notomi?et?al.2000；tomita?et?al.2008)、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling?circle?amplification，rca)(fire?and?xu?1995；liu?et?al.1996)、核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增(nuclear?acid?sequence-based?amplification，nasba)(compton?1991)、多重交叉置換擴(kuò)增(multipledilacement?amplification，mda)(wang?et?al.2015)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase?polymerase?amplification)(rpa)(piepenburg?et?al.2006；yonesaki?and?minagawa?1985)、鏈置換擴(kuò)增(strand?displacement?amplification，sda)(walker?et?al.1992)、交叉引物擴(kuò)增(crossing?priming?isothermal?amplification,cpa)(fang?et?al.2009)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(helicase-dependent?isothermaldnaamplification，hda)(vincent?et?al.2004)等。在這些技術(shù)中，rpa在反應(yīng)中依賴重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白和鏈置換dna聚合酶，由于其靈敏度高、操作和引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、擴(kuò)增速度快和反應(yīng)溫度低(37-42℃)，顯示出發(fā)展poct技術(shù)的巨大潛力(ding?et?al.2019；magroet?al.2017；piepenburg?et?al.2006)。值得注意的是，基于金膠體的橫向流動(dòng)分析是將rpa產(chǎn)品轉(zhuǎn)換為視覺(jué)信號(hào)的技術(shù)之一(li?et?al.2019)。然而，該方法的靈敏度仍需提高才能達(dá)到rt-pcr的水平(patchsung?et?al.2020；tang?et?al.2022)。
3、此外，與天然酶相比，納米酶具有高穩(wěn)定性、低成本和可調(diào)節(jié)的催化活性，使其成為開(kāi)發(fā)poct的理想候選物。這些基礎(chǔ)研究鼓勵(lì)本專利技術(shù)人擴(kuò)展用于核酸檢測(cè)的納米酶試紙條，以應(yīng)對(duì)covid-19等病毒感染的挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的一個(gè)方面涉及一種用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其包括：
2、1)擴(kuò)增樣品核酸的等溫?cái)U(kuò)增裝置，其包含通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增來(lái)擴(kuò)增樣品核酸的靶基因正向引物、反向引物及等溫?cái)U(kuò)增試劑；
3、2)單獨(dú)存在的fes2納米酶試紙條；
4、3)單獨(dú)存在的fes2納米酶探針；和
5、4)單獨(dú)存在的fes2納米酶試紙條顯色水溶液，
6、其中擴(kuò)增樣品核酸的正向和反向引物之一用生物素標(biāo)記，另一條用地高辛、fifc或6-fam標(biāo)記，其中所述fes2納米酶試紙條包括底板以及依次搭接粘貼在底板上的樣品墊、多孔固體支持物和吸水墊，所述多孔固體支持物上含有測(cè)試線和質(zhì)控線，所述測(cè)試線含有與相應(yīng)的引物標(biāo)記地高辛、fifc或6-fam標(biāo)記特異性結(jié)合的抗體，所述質(zhì)控線含有白蛋白-生物素復(fù)合物或白蛋白-抗抗生物素二抗復(fù)合物，其中所述fes2納米酶探針通過(guò)用鏈霉親和素或抗生物素抗體修飾fes2納米酶獲得，其中所述fes2納米酶試紙條顯色水溶液包含h2o2以及選自沉淀型tmb、dab或aec的化合物。
7、在一些實(shí)施方案中，所述fes2納米酶的粒徑為255.4±15.9nm，優(yōu)選地，所述fes2納米酶通過(guò)meng等人，acs?nano?15(3),5735-5751中所述的方法制備。
8、在一些實(shí)施方案中，等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增、多重交叉置換擴(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增、交叉引物擴(kuò)增或解旋酶依賴性擴(kuò)增裝置，優(yōu)選地，其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增裝置。
9、在一些實(shí)施方案中，所述樣品為生物樣品或環(huán)境樣品，優(yōu)選地，所述生物樣品選自唾液、血液、痰液、血清、腹水和/或拭子浸出液，和/或優(yōu)選地，所述環(huán)境樣品獲自疑似受污染的冷凍食品外包裝、地面、墻壁、扶手、水池、下水道、臺(tái)面、桌面、空調(diào)管路、蔬菜、水果、肉制品和/或水產(chǎn)品，更優(yōu)選地，所述生物樣品獲自人類受試者。
10、在一些實(shí)施方案中，所述微生物選自病原微生物，優(yōu)選地，所述病原微生物選自病毒、細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體或真菌，優(yōu)選地，所述病原微生物選自病毒、細(xì)菌或真菌，更優(yōu)選地，所述病原微生物選自dna病毒和/或rna病毒，更優(yōu)選地，所述病原微生物選自covid-19病毒、hiv病毒、肝本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述FeS2納米酶的粒徑為255.4±15.9nm，優(yōu)選地，所述FeS2納米酶通過(guò)Meng等人，ACS?Nano15(3),5735-5751中所述的方法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增、多重交叉置換擴(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增、交叉引物擴(kuò)增或解旋酶依賴性擴(kuò)增裝置，優(yōu)選地，其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述樣品為生物樣品或環(huán)境樣品，優(yōu)選地，所述生物樣品選自唾液、血液、痰液、血清、腹水和/或拭子浸出液，和/或優(yōu)選地，所述環(huán)境樣品獲自疑似受污染的冷凍食品外包裝、地面、墻壁、扶手、水池、下水道、臺(tái)面、桌面、空調(diào)管路、蔬菜、水果、肉制品和/或水產(chǎn)品，更優(yōu)選地，所述生物樣品獲自人類受試者。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中1)擴(kuò)增樣品核酸的等溫?cái)U(kuò)增裝置和2)FeS2納米酶試紙條處于一體式結(jié)構(gòu)的分隔的隔斷中，優(yōu)選地，容納1)擴(kuò)增樣品核酸的等溫?cái)U(kuò)增裝置和2)FeS2納米酶試紙條的隔斷直接相鄰并設(shè)置有將二者密封隔開(kāi)的分隔物，更優(yōu)選地，所述分隔物為一體成型的膜片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其還包含樣品獲取裝置，優(yōu)選地，所述樣品獲取裝置為拭子、刮片、注射器或吸管，及任選的容器或密封袋，其用于容納所述拭子、刮片、注射器或吸管。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其還包含樣品核酸提取裝置。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中擴(kuò)增樣品核酸的正向和反向引物之一用生物素標(biāo)記，另一條用地高辛標(biāo)記，和/或其中所述測(cè)試線含有與地高辛標(biāo)記特異性結(jié)合的抗體且所述質(zhì)控線含有白蛋白-生物素復(fù)合物，且其中所述FeS2納米酶用鏈霉親和素修飾，優(yōu)選地，所述FeS2納米酶與其上修飾的鏈霉親和素的重量比為10：1-1：2，優(yōu)選地，5：1-1：1，更優(yōu)選地，3：1-1：1，甚至更優(yōu)選地，2：1-1：1，和/或其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增裝置，和/或其中顯色底物為TMB，和/或其中顯色水溶液中催化底物H2O2體積比含量為5-60％，優(yōu)選地，10-50％，更優(yōu)選地，15-40％，甚至更優(yōu)選地，20-35％，和/或其中納米酶探針的用量為0.2-6μg，優(yōu)選地，0.5-4μg，更優(yōu)選地，1-3μg，甚至更優(yōu)選地，1.5-2.5μg，和/或其中納米酶催化作用的時(shí)間為2-15min，優(yōu)選地，3-10min，更優(yōu)選地，4-8min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中微生物為SARS-CoV-2或HPV-16，且其中所用靶基因序列及引物序列分別如SEQ?ID?NO：1-9任一項(xiàng)所示。
11.一種檢測(cè)樣品中微生物存在的方法，其利用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行，其包括如下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述fes2納米酶的粒徑為255.4±15.9nm，優(yōu)選地，所述fes2納米酶通過(guò)meng等人，acs?nano15(3),5735-5751中所述的方法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增、多重交叉置換擴(kuò)增、鏈置換擴(kuò)增、交叉引物擴(kuò)增或解旋酶依賴性擴(kuò)增裝置，優(yōu)選地，其中等溫?cái)U(kuò)增裝置是重組酶聚合酶擴(kuò)增裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述樣品為生物樣品或環(huán)境樣品，優(yōu)選地，所述生物樣品選自唾液、血液、痰液、血清、腹水和/或拭子浸出液，和/或優(yōu)選地，所述環(huán)境樣品獲自疑似受污染的冷凍食品外包裝、地面、墻壁、扶手、水池、下水道、臺(tái)面、桌面、空調(diào)管路、蔬菜、水果、肉制品和/或水產(chǎn)品，更優(yōu)選地，所述生物樣品獲自人類受試者。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中所述微生物選自病原微生物，優(yōu)選地，所述病原微生物選自病毒、細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體或真菌，優(yōu)選地，所述病原微生物選自病毒、細(xì)菌或真菌，更優(yōu)選地，所述病原微生物選自dna病毒和/或rna病毒，更優(yōu)選地，所述病原微生物選自covid-19病毒、hiv病毒、肝炎病毒、狂犬病病毒、sars病毒、流感病毒、高致病性禽流感病毒、皰疹病毒、乳頭瘤病毒、埃博拉病毒、天花病毒、麻疹病毒、登革病毒、黃熱病毒、馬爾堡病毒、裂谷熱病毒和西尼羅病毒；鼠疫桿菌、炭疽桿菌、麻風(fēng)桿菌、結(jié)核桿菌、肉毒桿菌、破傷風(fēng)桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、嗜血桿菌、霍亂弧菌、淋病雙球菌、腦膜炎雙球菌和金黃色葡萄菌；毛廯菌、白色念珠菌、新型隱球菌和包氏放線菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)生物樣品中微生物存在的檢測(cè)系統(tǒng)，其中1)擴(kuò)增樣品核酸的等溫?cái)U(kuò)增裝置...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：閻錫蘊(yùn)，高利增，段德民，孟祥芹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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