【技術實現步驟摘要】
本申請涉及細胞療法領域，特別涉及一種靶向gd2的細胞療法及其相關應用。
技術介紹
1、嵌合抗原受體簡稱car(chimerie?antigen?receptor)，主要由腫瘤抗原特異性的單鏈抗體(scfv)、共刺激域和t細胞受體(tcr)cd3ζ鏈的信號結構域直接耦合而成，因此腫瘤抗原可以繞過常規的抗原提呈和諸多調控環節的限制，直接通過激活car受體而激活t細胞使其發揮免疫殺傷作用。car-t療法是目前備受關注的t細胞過繼免疫療法，在治療血液腫瘤方面取得了巨大成功并已成功應用于臨床治療。
2、近年來針對各種實體瘤的car-t療法也正在如火如荼地進行，但大多數研究均止步于臨床試驗階段，目前認為限制car-t療法在實體腫瘤中發揮有效作用的主要因素可能有：腫瘤抗原的多樣性與非特異性、car-t細胞的功能不全與耗竭、car-t細胞增殖能力有限、car-t細胞不易透過腫瘤屏障以及高度免疫抑制的腫瘤微環境。
3、gd2(雙唾液酸神經節苷脂)在腦膠質瘤和神經母細胞瘤中常有高表達，是該類腫瘤免疫治療的特異性靶點。依此設計的以14g2a單鏈抗體作為抗原識別域的gd2.car-t細胞，正在被廣泛地應用到針對腦膠質瘤和神經母細胞瘤的臨床前和臨床試驗中。然而，研究發現gd2.car-t細胞非常容易在培養的過程中就提前進入細胞耗竭狀態，導致其抗腫瘤效果不佳，而這與其會產生一種抗原非依賴性的固有激活信號有關。目前已有一些研究試圖通過降低gd2.car-t細胞的固有激活信號來提高它的抗腫瘤功效，但該信號產生的具體機制目前尚不明確。p>
技術實現思路
1、鑒于以上所述現有技術的缺點，為解決現有技術中gd2.car-t細胞提前進入細胞耗竭狀態，導致其抗腫瘤效果不佳這一技術問題，本申請的目的在于提供一種靶向gd2的細胞療法及其相關應用，通過優化gd2.car?scfv結構表面的正電荷分布來獲得固有信號減弱、自發耗竭改善和抗腫瘤活性提高的gd2.car結構。
2、為實現上述目的及其他相關目的，本申請第一方面提供一種抗gd2的scfv，所述scfv包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括4個框架區hfr1、hfr2、hfr3和hfr4，所述輕鏈可變區包括4個框架區lfr1、lfr2、lfr3和lfr4；所述scfv序列相比野生型scfv序列，hfr區和/或lfr區中若干個帶正電荷的氨基酸突變為不帶電的氨基酸。
3、本申請第二方面提供所述的抗gd2的scfv用于構建靶向gd2的嵌合抗原受體的用途。
4、本申請第三方面提供一種靶向gd2的嵌合抗原受體，包括依次相連的胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域；所述胞外結構域包括所述的抗gd2的scfv序列。
5、本申請第四方面提供一種多核苷酸，編碼所述的嵌合抗原受體。
6、本申請第五方面提供一種重組表達載體，含有所述的多核苷酸。
7、本申請第六方面提供一種轉化體，含有所述的重組表達載體。
8、本申請第七方面提供一種基因修飾的細胞，含有所述的嵌合抗原受體。
9、本申請第八方面提供一種藥物組合物，含有所述的多核苷酸，或含有所述的重組表達載體，或含有所述的轉化體，或含有所述的基因修飾的細胞。
10、本申請第九方面提供所述的抗gd2的scfv，所述的嵌合抗原受體，所述的重組表達載體，所述的轉化體，所述的基因修飾的細胞，所述的藥物組合物在制備腫瘤治療產品中的應用；優選地，所述腫瘤治療為腫瘤免疫治療。
11、與現有技術相比，本申請的有益效果為：
12、1、本專利技術首次通過蛋白工程的方式將gd2.car中scfv區域的正電性氨基酸進行突變，通過減少scfv蛋白表面的正電荷斑塊來減弱gd2.car的自發聚集，進而減輕gd2.car-t細胞的固有信號和耗竭水平，最終達到提高gd2.car-t抗腫瘤功效的目的。
13、2、本專利技術為高固有信號car-t療法的優化改造提供了一種方法，尤其是為這類car-t細胞自發耗竭的難題提供了一種解決思路。
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1.一種抗GD2的scFv，其特征在于，所述scFv包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括4個框架區HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，所述輕鏈可變區包括4個框架區LFR1、LFR2、LFR3和LFR4；所述scFv序列相比野生型scFv序列，HFR區和/或LFR區中若干個帶正電荷的氨基酸突變為不帶電的氨基酸。
2.如權利要求1所述的抗GD2的scFv，其特征在于，所述野生型scFv選自14g2a或14g2a-E101K序列。
3.如權利要求1所述的抗GD2的scFv，其特征在于，所述帶正電的氨基酸選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸中的任一種或多種；
4.如權利要求1所述的抗GD2的scFv，其特征在于，所述突變的位點包括所述輕鏈可變區的LFR2和/或LFR4；優選地，所述輕鏈可變區突變的LFR2包含如SEQ?ID?NO：3所示的序列；所述輕鏈可變區突變的LFR4包含如SEQ?ID?NO：4所示的序列；
5.如權利要求1所述的抗GD2的scFv，其特征在于，所述scFv序列選自SEQ?ID?NO：9或SEQ?ID?NO：10或S
6.如權利要求1～5任一項所述的抗GD2的scFv用于構建靶向GD2的嵌合抗原受體的用途。
7.一種靶向GD2的嵌合抗原受體，其特征在于，包括依次相連的胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域；所述胞外結構域包括如權利要求1～5任一項所述的抗GD2的scFv序列。
8.如權利要求7所述的嵌合抗原受體，其特征在于，
9.如權利要求7所述的嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列包括如SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19、SEQ?ID?NO：20和SEQ?ID?NO：21所示。
10.一種多核苷酸，編碼如權利要求7～9任一項所述的嵌合抗原受體。
11.一種重組表達載體，含有如權利要求10所述的多核苷酸。
12.一種轉化體，含有如權利要求11所述的重組表達載體。
13.一種基因修飾的細胞，含有如權利要求7～9任一項所述的嵌合抗原受體。
14.一種藥物組合物，含有如權利要求10所述的多核苷酸，或含有如權利要求11所述的重組表達載體，或含有如權利要求12所述的轉化體，或含有如權利要求13所述的基因修飾的細胞。
15.如權利要求1～5任一項所述的抗GD2的scFv，如權利要求7～9任一項所述的嵌合抗原受體，如權利要求10所述的多核苷酸，如權利要求11所述的重組表達載體，如權利要求12所述的轉化體，如權利要求13所述的基因修飾的細胞，如權利要求14所述的藥物組合物在制備腫瘤治療產品中的應用；優選地，所述腫瘤治療為腫瘤免疫治療。
...【技術特征摘要】
1.一種抗gd2的scfv，其特征在于，所述scfv包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包括4個框架區hfr1、hfr2、hfr3和hfr4，所述輕鏈可變區包括4個框架區lfr1、lfr2、lfr3和lfr4；所述scfv序列相比野生型scfv序列，hfr區和/或lfr區中若干個帶正電荷的氨基酸突變為不帶電的氨基酸。
2.如權利要求1所述的抗gd2的scfv，其特征在于，所述野生型scfv選自14g2a或14g2a-e101k序列。
3.如權利要求1所述的抗gd2的scfv，其特征在于，所述帶正電的氨基酸選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸中的任一種或多種；
4.如權利要求1所述的抗gd2的scfv，其特征在于，所述突變的位點包括所述輕鏈可變區的lfr2和/或lfr4；優選地，所述輕鏈可變區突變的lfr2包含如seq?id?no：3所示的序列；所述輕鏈可變區突變的lfr4包含如seq?id?no：4所示的序列；
5.如權利要求1所述的抗gd2的scfv，其特征在于，所述scfv序列選自seq?id?no：9或seq?id?no：10或seq?id?no：11或seq?id?no：12所示的序列。
6.如權利要求1～5任一項所述的抗gd2的scfv用于構建靶向gd2的嵌合抗原受體的用途。
7.一種靶向gd2的嵌合抗原受體，其特征在于...
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