表達(dá)豬β干擾素的CHO細(xì)胞系及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了表達(dá)脊椎動(dòng)物β干擾素的ＣＨＯ細(xì)胞系，其含有編碼所述動(dòng)物β干擾素的基因。更具體地，本發(fā)明專利技術(shù)公開了表達(dá)豬β干擾素的ＣＨＯ細(xì)胞系。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及利用上述ＣＨＯ細(xì)胞系生產(chǎn)脊椎動(dòng)物β干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方法以及通過該方法獲得的豬β干擾素，其具有極高的比活性和穩(wěn)定性，可用作豬β干擾素生物學(xué)活性檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和用于豬傳染性疾病的預(yù)防和治療，具有重要的應(yīng)用前景和市場(chǎng)前景。

CHO cell line expressing porcine beta interferon and uses thereof

The present invention discloses a CHO cell line expressing vertebrate beta interferon, which contains a gene encoding the animal beta interferon. More specifically, the present invention discloses a CHO cell line expressing porcine interferon beta. The invention also relates to methods of using the CHO cell line producing vertebrate beta interferon standard and porcine interferon beta obtained by this method, which has a high specific activity and stability, prevention and treatment of the standard can be used to detect biological activity of porcine interferon beta and for porcine infectious diseases, and has important application prospect and the market prospect.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及表達(dá)脊椎動(dòng)物P干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼所述 動(dòng)物(3干擾素的基因。更具體地，本專利技術(shù)公開了表達(dá)豬(3干擾素的CHO 細(xì)胞系。本專利技術(shù)還涉及利用上述CHO細(xì)胞系生產(chǎn)豬P干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方 法以及通過該方法獲得的的豬(3干擾素，其具有極高的比活性和穩(wěn)定性， 可用作豬卩干擾素生物學(xué)活性檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品和用于豬傳染性疾病的預(yù)防 和治療。
技術(shù)介紹
I型干擾素是脊椎動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的 重要研究領(lǐng)域。如今，病毒感染宿主時(shí)逃避干擾素等天然免疫的機(jī)制成為 研究熱點(diǎn)[1—3]，這為病毒防治在理論上提供有力支持。豬生殖與呼吸綜合癥 病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) [4'5]、 偽狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)[6，7〗、豬動(dòng)脈炎病毒(swine arterivirus ， PoAV) [8]、豬瘟病毒(swine fever virus) [91]和豬傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV ) [12]等病毒在感染宿主時(shí)，破 壞I型干擾素系統(tǒng)都為它們突破宿主免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要的機(jī)制。I型干擾素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [13'14]、慢性丙型 肝炎(chronic hepatitis C) [15]、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis) [16]、腫 瘤疾病[17'18]及其它疾病[19'2()]的治療中發(fā)揮了重要作用。豬I型干擾素對(duì) TGEV[21]、豬瘟病毒[22]、 PRV^^等常見病毒病的治療具有良好的前景。 目前，國內(nèi)豬I型干擾素的生產(chǎn)主要采用原核[25'26]和酵母表達(dá)系統(tǒng)[27，28]。因此，不管是I型干擾素相關(guān)的基礎(chǔ)研究還是臨床使用，都需要高活 性、天然的I型干擾素樣品，此外還需要對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行準(zhǔn)確、便捷 的定量。干擾素的定量需要穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，目前農(nóng)業(yè)部頒布的獸用生物制 品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的脊椎動(dòng)物天然豬白細(xì)胞干擾素是以雞新城疫病毒誘導(dǎo)豬白細(xì)胞獲得的，制作工藝和產(chǎn)品成分復(fù)雜，最終產(chǎn)品的活性較低，約為10000 AU， mL'1。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的脊椎動(dòng)物干擾素是與其它表達(dá)系統(tǒng) 相比能夠正確折疊、糖基化和翻譯后修飾，因此更穩(wěn)定、比活性更高、更 適合作為標(biāo)準(zhǔn)品，尤其對(duì)于IFN-p，而目前缺乏源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的脊椎 動(dòng)物豬的IFN-(3標(biāo)準(zhǔn)品。綜上，獲得高水平哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的脊椎動(dòng)物 豬I型干擾素具有重要的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的為建立高效表達(dá)豬IFN-(3的CH0-K1細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。 具體地，本專利技術(shù)涉及如下各項(xiàng)1. 一種表達(dá)豬卩干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼豬(3干擾素的基因。2. 根據(jù)以上l所述的CHO細(xì)胞系，其中所述豬P干擾素的氨基酸序 列如SEQ IDNO:2所示。3. 根據(jù)以上1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述編碼豬(3干擾素的基因 如SEQIDNO: 1所示。4. 根據(jù)以上1-3任一項(xiàng)所述的CHO細(xì)胞系，其中在所述編碼豬卩干 擾素的基因之前加入了 Kozak序列。5. 根據(jù)以上1所述的CHO細(xì)胞系，其是保藏號(hào)為CGMCC No. 2412 的CHO細(xì)胞系。6. —種生產(chǎn)豬(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的方法，該方法包括1) 培養(yǎng)根據(jù)以上1至5中任何一項(xiàng)所述的CHO細(xì)胞系；2) 從所述的CHO細(xì)胞系的培養(yǎng)液中提取(3干擾素，用作豬p干擾素 的標(biāo)準(zhǔn)品。 一7. 根據(jù)以上6的方法，其中所述CHO細(xì)胞系是保藏號(hào)為CGMCC No. 2412的CHO細(xì)胞系。8. 根據(jù)以上6或7的方法生產(chǎn)的豬(3干擾素標(biāo)準(zhǔn)品。9. 一種試劑盒，其包含根據(jù)以上6或7的方法生產(chǎn)的豬卩干擾素標(biāo)準(zhǔn) 品。所述試劑盒可以用于豬傳染性疾病的預(yù)防和治療。10. 根據(jù)以上1至5中任何一項(xiàng)所述的CHO細(xì)胞系生產(chǎn)的豬|3干擾素4在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于豬傳染性疾病的預(yù)防和治療。所述疾 病例如是豬生殖與呼吸綜合癥病毒、偽狂犬病毒、豬動(dòng)脈炎病毒、豬瘟病 毒和豬傳染性胃腸炎病毒等病毒引起的疾病。更具體地，在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中，把豬(3干擾素(PoIFN-p)的 ORF基因克隆至真核穩(wěn)定表達(dá)載體pCI-neo (PoIFN-|3在高效啟動(dòng)子CMV 控制下表達(dá))，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CH0-K1細(xì)胞，經(jīng)G418壓力篩選和2次單 克隆，篩選出可穩(wěn)定表達(dá)重組PoIFN-p的CH0-K1細(xì)胞克隆 (CHO-PoIFN-p)。本專利技術(shù)的一株陽性CHO細(xì)胞克隆(CHO-PoIFN-P，分 類命名中國倉鼠卵巢細(xì)胞(C7n'e化//amww Ova^ CW/))于2008年3月 25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC， 中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2412。在25cr^的細(xì)胞瓶(5ml培養(yǎng) 液)中，重組PoIFN-卩的累積表達(dá)水平達(dá)到7.7Xl()5AU (antiviral units) /ml，每天的表達(dá)量可達(dá)4.6Xl()5AU/ml或0.46AU/個(gè)細(xì)胞。CHO-PoIFN-p 細(xì)胞可在無G418壓力篩選下穩(wěn)定表達(dá)至少20代。表達(dá)的重組PoIFN-P 可以誘導(dǎo)PK15細(xì)胞表達(dá)豬Mx蛋白。此外，其還可以完全保護(hù)PK15細(xì) 胞抵抗1000 TCID5Q的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和偽狂犬病毒(PRV) 的感染。綜上，本研究中CHO-PoIFN-P細(xì)胞穩(wěn)定、高效表達(dá)的重組PoIFN-卩 具有天然豬I型干擾素的生物學(xué)活性，具有良好的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究價(jià)值。本專利技術(shù)的專利性新穎性與已經(jīng)使用的表達(dá)脊椎動(dòng)物豬P干擾素的技術(shù)相比(目前干擾素表達(dá) 所采用的表達(dá)系統(tǒng)主要是原核、酵母表達(dá)系統(tǒng)，使用CHO表達(dá)脊椎動(dòng)物 豬|3干擾素的國內(nèi)外未見報(bào)道)，表達(dá)的技術(shù)路線完全不同。表達(dá)的產(chǎn)物 在折疊、糖基化、翻譯后修飾、穩(wěn)定性、比活性上要大大優(yōu)于已有的技術(shù) 手段(原核、酵母)。創(chuàng)造性1、 與己有的原核和酵母表達(dá)系統(tǒng)比較，本專利技術(shù)CHO表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出 的干擾素在蛋白的折疊、糖基化等翻譯后修飾上最接近于天然干擾素，比 活性更高，約是原核的10倍；2、 由于我們的目的是表達(dá)最接近天然活性的干擾素，而農(nóng)業(yè)部頒布的獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的天然豬白細(xì)胞干擾素是以雞新城疫病毒誘導(dǎo) 豬白細(xì)胞獲得的，制作工藝和產(chǎn)品成分復(fù)雜，最終產(chǎn)品的活性約10000AU mU1。與此相比較，本專利技術(shù)的表達(dá)系統(tǒng)的PoIFN-P的表達(dá)水平是其70 倍或以上，且工藝簡單、產(chǎn)品成分容易控制，具有極大的優(yōu)越性。綜上因此以CHO表達(dá)的豬P干擾素與原核和酵母表達(dá)的相比較具 有極大的優(yōu)越性和創(chuàng)造性。附圖簡述附圖說明圖1. pCA-PoIFN-J3 (A至D)禾卩pCAGGS (E)轉(zhuǎn)染BHK-21上清的 抗病毒活性滴定。表達(dá)pCA-PoIFN-P和pCAGGS的轉(zhuǎn)染的BHK-21的上 清分別被命名為PoIFN-卩pCA和mockpCA， PoIFN-卩pCA稀釋IOM咅(A), 105倍 (B)， 1()6倍(C), 10M咅(D)， mockpCA稀釋IOM咅(E),并且不含IFN但加入病毒 對(duì)照的孔被設(shè)定為病毒對(duì)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種表達(dá)豬β干擾素的ＣＨＯ細(xì)胞系，其含有編碼豬β干擾素的基因。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達(dá)豬β干擾素的CHO細(xì)胞系，其含有編碼豬β干擾素的基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述豬(3干擾素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其中所述編碼豬(3干擾素的 基因如SEQ ID NO: 1所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的CHO細(xì)胞系，其中在所述編碼豬卩 干擾素的基因之前加入了 Kozak序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞系，其是保藏號(hào)為CGMCC No. 2412的CHO細(xì)胞系。6. —種生產(chǎn)豬卩干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：步志高，陳偉業(yè)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：93[中國|哈爾濱]