【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于微生物，具體涉及一株沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022及其連續(xù)化生產(chǎn)工藝和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；透呙芏瑞B(yǎng)殖成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢，但是較高密度的養(yǎng)殖環(huán)境給疾病的發(fā)生帶來隱患，其中，沙門氏菌病是嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的原因之一?？股氐氖褂每梢暂^好地預(yù)防和治療沙門氏菌病，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但是隨著抗生素的廣泛、不合理、過度的使用，細(xì)菌對抗生素也逐漸產(chǎn)生耐藥性。對于臨床嚴(yán)重感染的病例，抗生素已經(jīng)無法發(fā)揮其抗菌抑菌的作用，從而造成養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失。噬菌體是一類可以感染細(xì)菌的病毒，是病毒中最為普遍、分布最為廣泛的群體。通常情況下，充滿細(xì)菌群落的地方，如飼養(yǎng)場、動物胃腸道等都可以找到噬菌體。當(dāng)過度使用抗生素的弊端逐漸顯現(xiàn)、超強(qiáng)耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)時(shí)，噬菌體發(fā)展到動物疾病的預(yù)防，種畜禽場和水產(chǎn)業(yè)細(xì)菌性疾病的凈化，飼料和水源中細(xì)菌的清除及食品安全衛(wèi)生等方面，急需噬菌體的規(guī)模化生產(chǎn)。
2、目前沙門氏菌噬菌體的傳統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)中，存在以下問題：第一，每批次發(fā)酵結(jié)束后需要對發(fā)酵罐和相關(guān)管道、設(shè)備徹底的清洗、消毒以及滅菌處理，發(fā)酵設(shè)備在清洗消毒階段無法用于實(shí)際生產(chǎn)，此外，在啟動新的發(fā)酵批次時(shí)，也需要一段時(shí)間讓噬菌體宿主細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，如此降低了設(shè)備的使用效率；第二，以上非生產(chǎn)性操作占據(jù)了一定的時(shí)間，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低，同時(shí)，長時(shí)間的分批發(fā)酵可能導(dǎo)致宿主菌株發(fā)生變異或產(chǎn)生抗噬菌體的能力，使得噬菌體無法有效感染宿主細(xì)胞，也是生產(chǎn)效率低的一個(gè)原因；第三，在現(xiàn)有的發(fā)酵中，一般一次性添加所有培養(yǎng)基，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022及其連續(xù)化生產(chǎn)工藝和應(yīng)用。本專利技術(shù)采用三級串聯(lián)連續(xù)發(fā)酵，在連續(xù)發(fā)酵過程中，不僅提高了設(shè)備的使用效率，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，而且連續(xù)發(fā)酵使噬菌體和宿主得到共同進(jìn)化，噬菌體的生物學(xué)特性大幅度提升。
2、本專利技術(shù)上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供了一株沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022，從山東青島發(fā)病養(yǎng)殖雞場病雞肝臟獲得，于2022年09月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為cgmcc?no.45272。本專利技術(shù)實(shí)驗(yàn)所用宿主菌為沙門氏菌菌bs-22024，于山東青島某發(fā)病養(yǎng)殖雞場病雞肝臟分離得到，與本專利技術(shù)沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022一起保藏。
4、經(jīng)電鏡觀察：所述沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022具有一多面體立體對稱的頭部及與所述頭部相連的尾部，所述頭部內(nèi)包裹核酸，所述頭部直徑為55nm，所述尾部長度為130nm，根據(jù)病毒分類國際委員會(ictv)的分類標(biāo)準(zhǔn)鑒定，該噬菌體歸類為有尾病毒目長尾病毒科。
5、第二方面，本專利技術(shù)提供了一種噬菌體組合物，包括如上所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022。
6、第三方面，本專利技術(shù)提供了如上所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022或者如上所述的噬菌體組合物在制備以下至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用：(1)殺滅或抑制沙門氏菌的產(chǎn)品；(2)預(yù)防和/或治療沙門氏菌所引起的家禽疾病的產(chǎn)品；(3)預(yù)防和/或治療沙門氏菌引起的炎癥反應(yīng)的產(chǎn)品。
7、第四方面，本專利技術(shù)提供了一種如上所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：
8、步驟一、種子液的制備：
9、(1)制備沙門氏菌宿主菌種子液；優(yōu)選的，所述沙門氏菌宿主菌采用沙門氏菌bs-22024。
10、(2)制備沙門氏菌噬菌體種子液；優(yōu)選的，沙門氏菌噬菌體采用沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022。
11、步驟二、沙門氏菌噬菌體的連續(xù)增殖：
12、(1)在補(bǔ)料罐a配置好第一培養(yǎng)基，在噬菌體種子罐b和宿主菌種子罐c中配置好第二培養(yǎng)基，調(diào)整ph，然后滅菌備用；噬菌體增殖罐d1、噬菌體增殖罐d2和噬菌體增殖罐d3空消后備用；
13、(2)在噬菌體種子罐b中，接種宿主菌種子液，培養(yǎng)4-6h后，再接入噬菌體種子液，連續(xù)培養(yǎng)36-48h，即得噬菌體增殖液；優(yōu)選的，在噬菌體種子罐b中，接種2％的宿主菌種子液，培養(yǎng)4-6h后，再接入2％的噬菌體種子液，連續(xù)培養(yǎng)36-48h，即得噬菌體增殖液；
14、(3)在噬菌體種子罐b接入噬菌體種子液30-50h后，在宿主菌種子罐c中接入宿主菌種子液，連續(xù)培養(yǎng)4-6h，即得宿主菌增殖液；優(yōu)選的，在噬菌體種子罐b接入噬菌體種子液40h后，在宿主菌種子罐c中接入2％的宿主菌種子液，連續(xù)培養(yǎng)4-6h，即得宿主菌增殖液；
15、(4)將制備好的宿主菌增殖液以恒定速度流加到噬菌體增殖罐d1中；再將制備好的噬菌體增殖液以相同的恒定速度流加到噬菌體增殖罐d1中；待噬菌體增殖罐d1中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以一定的轉(zhuǎn)移速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d2中，待噬菌體增殖罐d2中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以相同的轉(zhuǎn)移速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d3中，待噬菌體增殖罐d3中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以相同的轉(zhuǎn)移速度轉(zhuǎn)移終產(chǎn)物噬菌體發(fā)酵液到存儲罐中。優(yōu)選的，所述恒定速度為以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.4-0.6％的速度；所述轉(zhuǎn)移速度為每分鐘占噬菌體增殖罐d2或者噬菌體增殖罐d3總體積的0.8-1.2％的速度；優(yōu)選的，所述噬菌體增殖罐d1、噬菌體增殖罐d2和噬菌體增殖罐d3的體積相同。
16、優(yōu)選的，所述步驟二中步驟(4)的具體步驟如下：將制備好的宿主菌增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.4-0.6％的速度流加到噬菌體增殖罐d1中；再將制備好的噬菌體增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.4-0.6％的速度流加到噬菌體增殖罐d1中；待噬菌體增殖罐d1中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以每分鐘占噬菌體增殖罐d2總體積的0.8-1.2％的速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d2中，待噬菌體增殖罐d2中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以每分鐘占噬菌體增殖罐d3總體積的0.8-1.2％的速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d3中，待噬菌體增殖罐d3中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以每分鐘占噬菌體增殖罐d3總體積的0.8-1.2％的速度轉(zhuǎn)移終產(chǎn)物噬菌體發(fā)酵液到存儲罐中。更優(yōu)選的，所述恒定速度為以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.6％的速度；所述轉(zhuǎn)移速度為每分鐘占噬菌體增殖罐d2或者噬菌體增殖罐d3總體積的1.2％的速度；優(yōu)選的，待噬菌體增殖罐d1、噬菌體增殖罐d2或者噬菌體增殖罐d3中的增殖液達(dá)到罐體積的70％時(shí)將增值液轉(zhuǎn)移。
17、如上所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，所述步驟二中補(bǔ)料罐a中的第一培養(yǎng)基成分為：酵母浸粉2.5％，甘油0.5％，氯化鈉0本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一株沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022，其特征在于，其保藏編號為CGMCC?No.45272，于2022年09月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種噬菌體組合物，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022或者權(quán)利要求2所述的噬菌體組合物在制備以下至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用：(1)殺滅或抑制沙門氏菌的產(chǎn)品；(2)預(yù)防和/或治療沙門氏菌所引起的家禽疾病的產(chǎn)品；(3)預(yù)防和/或治療沙門氏菌引起的炎癥反應(yīng)的產(chǎn)品。
4.一種如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟二中步驟(4)的具體步驟如下：將制備好的宿主菌增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐D(zhuǎn)1總體積的0.4-0.6％的速度流加到噬菌體增殖罐D(zhuǎn)1中；再將制備好的噬菌體增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐D(zhuǎn)1總體積的0.4
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟二中，在沙門氏菌噬菌體的連續(xù)增殖過程中，根據(jù)噬菌體種子罐B和宿主菌種子罐C內(nèi)第二培養(yǎng)基的各自的消耗速度，分別以與各自的消耗速度相同的速度從補(bǔ)料罐A補(bǔ)加第一培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟二中噬菌體種子罐B、宿主菌種子罐C、噬菌體增殖罐D(zhuǎn)1、噬菌體增殖罐D(zhuǎn)2、噬菌體增殖D3的參數(shù)為：轉(zhuǎn)速為200-300rpm，溫度為37℃，通氣為1∶0.6-0.8vvm；pH為7.5±0.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌噬菌體RDP-SA-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟二中補(bǔ)料罐A中的第一培養(yǎng)基成分為：酵母浸粉2.5％，甘油0.5％，氯化鈉0.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，氯化鎂20ppm，氯化鈣20ppm，以上為質(zhì)量比體積(w/v)；pH為6.0±0.2。
9.一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)噬菌體制劑的制備方法，其特征在于，采用權(quán)利要求4～7任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)工藝進(jìn)行生產(chǎn)發(fā)酵，將獲得的終產(chǎn)物噬菌體發(fā)酵液進(jìn)行后處理，制備得到噬菌體制劑，具體步驟如下：
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)噬菌體制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(6)中真空干燥采用真空帶式干燥機(jī)干燥。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一株沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022，其特征在于，其保藏編號為cgmcc?no.45272，于2022年09月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種噬菌體組合物，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022或者權(quán)利要求2所述的噬菌體組合物在制備以下至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用：(1)殺滅或抑制沙門氏菌的產(chǎn)品；(2)預(yù)防和/或治療沙門氏菌所引起的家禽疾病的產(chǎn)品；(3)預(yù)防和/或治療沙門氏菌引起的炎癥反應(yīng)的產(chǎn)品。
4.一種如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌噬菌體rdp-sa-22022的連續(xù)化生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟二中步驟(4)的具體步驟如下：將制備好的宿主菌增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.4-0.6％的速度流加到噬菌體增殖罐d1中；再將制備好的噬菌體增殖液以每分鐘占噬菌體增殖罐d1總體積的0.4-0.6％的速度流加到噬菌體增殖罐d1中；待噬菌體增殖罐d1中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以每分鐘占噬菌體增殖罐d2總體積的0.8-1.2％的速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d2中，待噬菌體增殖罐d2中的增殖液達(dá)到罐體積的70％-80％時(shí)，再以每分鐘占噬菌體增殖罐d3總體積的0.8-1.2％的速度將增殖液轉(zhuǎn)移到噬菌體增殖罐d3中，待噬菌體增殖罐d3中的增...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：杜新永，劉長太，李先勝，張朝壯，付睿，
申請(專利權(quán))人：青島潤達(dá)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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