【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程、抗體工程、細胞工程等，尤其涉及單個b淋巴細胞高效克隆抗體igg重鏈全長基因的方法。
技術介紹
1、1975年以細胞融合為基礎的兔雜交瘤技術問世，開創了制備單克隆抗體的新時代，兔源單克隆抗體高度的特異性和均一性使其在檢測、臨床治療中均顯示了巨大的應用價值。
2、目前制備兔單克隆抗體的技術方案有3種，一是雜交瘤技術，即利用兔骨髓瘤細胞與b淋巴細胞進行融合來制備單克隆抗體。但與鼠雜交瘤技術不同的是，可能是由于兔強大的免疫系統，無法像小鼠一樣被化學誘導產生骨髄瘤，從而難以建立用于制備雜交瘤單克隆抗體的融合細胞株。芝加哥loyola大學的katherine?knight教授在上個世紀九十年代中期制備了世界上第一株兔源的雜交瘤，可以與b淋巴細胞融合分泌兔單克隆抗體，但第一代雜交瘤細胞株(240e-1)融合后分泌兔單克隆抗體產量低且不穩定。robert?pytela和朱偉民等在以240e-1為原始細胞株，并對其進行不斷的篩選，目前開發出能夠穩定產生抗體蛋白質的細胞株240e-w2與240e-w3。并申請了專利進行全面的保護。由于兔雜交瘤技術的專利限制，導致此技術其他公司難以應用；
3、二是通過噬菌體表達文庫進行篩選，即將編碼抗體的基因cdna片段與噬菌體表面蛋白的編碼基因融合后，以融合蛋白的形式呈現在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結構和生物活性。導入了各種各樣抗體基因的一群噬菌體，就構成一個展示各種各樣外源肽的噬菌體展示庫。當用一個抗原去篩查一個噬菌體展示庫時，就會選擇性地同與
4、三是利用b淋巴細胞分離篩選結合基因克隆技術直接獲得抗體輕重鏈可變區基因，在分別與已知的抗體fc區進行拼接，然后配對轉染細胞后進行活性單克隆抗體的篩選。
5、目前利用b淋巴細胞法進行抗體基因克隆通常是分2步，首先是通過巢式pcr或單細胞測序分別克隆抗體的輕重鏈的可變區序列，然后將獲得的可變區序列與固定的恒定區序列在體外進行拼接后進行表達和活性篩選。目前艾博抗(上海)貿易有限公司、亞諾法生技股份有限公司、南京德泰生物工程有限公司、優睿賽思(武漢)生物科技有限公司和蘇州締碼生物科技有限公司等是采取此工藝技術生產重組兔單克隆抗體。
6、由于抗體分子結構包括可變區和恒定區2個部分，上述技術獲得僅是抗體的可變區序列結構，后期需要進一步拼接上固定的抗體fc區序列，結合表達后的活性檢測以獲得單克隆抗體。上述工藝破壞了抗體在可變區和恒定區之間鉸鏈區的天然結構，需要對抗體輕重鏈基因進行隨機配對再驗證抗體活性，降低了抗體與抗原的親和力，制備的抗體不屬于真正意義上的兔源全結構抗體。
7、現有技術中尚無法實現從兔單個b淋巴細胞中克隆igg抗體重鏈全長基因序列，從而體外重組具有全天然結構的兔igg單克隆單克隆抗體。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供利用單個b淋巴細胞進行高效克隆兔igg重鏈全長基因的方法。
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術提供一種單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，所述方法包括：
4、(1)以兔外周全血(peripheral?blood?mononuclear?cell，pbmc)為樣本，利用密度梯度離心法，分離出淋巴細胞層，制備單核細胞懸液；
5、(2)利用磁珠分選技術對步驟(1)所述的單核細胞懸液進行第一次分選，得到陽性b淋巴細胞懸液；利用微流控技術對所述的陽性b淋巴細胞懸液進行第二次分選，得到單細胞；
6、(3)用單細胞裂解液對步驟(2)所述的單細胞進行裂解，所得裂解液通過反轉錄合成cdna；
7、(4)以步驟(3)所述的cdna為模板，以正向引物和反向引物進行pcr擴增，得到所述單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因；
8、所述正向引物為下列之一：
9、
10、所述反向引物為下列之一：
11、
12、優選地，所述正向引物為下列之一：
13、2-f、4-f、5-f、8-f、9-f、11-f、12-f、13-f；
14、所述反向引物為下列之一：
15、2-a、4-a、5-a、8-a、9-a、11-a、12-a、13-a。
16、進一步優選地，
17、所述正向引物為下列之一：
18、12-f、13-f；
19、所述反向引物為下列之一：
20、12-a、13-a。
21、特別優選地，所述正向引物為13-f，所述反向引物為13-a。
22、本專利技術提供了簡單、快速、高效的從單個b淋巴細胞中克隆兔igg抗體重鏈可全長基因序列的方法。本專利技術采用終點法直接克隆兔igg抗體重鏈可全長基因序列的方法，極大的簡化了制備兔單克隆抗體的步驟。根據保守區設計的引物可以有效擴增出兔igg抗體重鏈cdna全長基因序列。
23、在本專利技術的一個實施例中，步驟(1)中，所述兔外周全血是經過耳緣抽取的靜脈血。進一步，所述兔外周全血用樣本稀釋液進行稀釋后，利用兔淋巴分離液進行密度梯度分離，吸取第二層的淋巴細胞，用無鈣鎂的pbs緩沖液懸浮，得到所述單核細胞懸液。更進一步，所述兔外周全血與所述樣本稀釋液的體積比為1︰1；所述兔外周全血與所述兔淋巴分離液的體積比為1︰2；所述兔外周全血與所述無鈣鎂的pbs緩沖液的體積比為10︰3。本專利技術所用的兔外周全血取自4～9月齡的雌性或雄性新西蘭兔。
24、在本專利技術的一個實施例中，步驟(2)中，第一次分選為：將生物素化抗兔igg抗體與鏈霉素親和磁珠偶聯，得到標記磁珠；將所述標記磁珠與步驟(1)所述的單核細胞懸液于2-8℃下共孵育，通過磁力架分離上清后，以無鈣鎂的pbs緩沖液懸浮，得到陽性b淋巴細胞懸液。進一步，所述生物素化抗兔igg抗體與所述鏈霉素親和磁珠的質量比為20μg︰1mg；所述鏈霉素親和磁珠的質量以步驟(1)所述的單核細胞懸液的體積計為4μg/ml。
25、本專利技術避免了目前利用單一兔b淋巴細胞細胞表面的標志物進行分本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于所述方法包括：
2.如權利要求1所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于所述正向引物為下列之一：
3.如權利要求2所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：
4.如權利要求3所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：所述正向引物為13-F，所述反向引物為13-A。
5.如權利要求1所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：步驟(1)中，所述兔外周全血是經過耳緣抽取的靜脈血；所述兔外周全血用樣本稀釋液進行稀釋后，利用兔淋巴分離液進行密度梯度分離，吸取第二層的淋巴細胞，用無鈣鎂的PBS緩沖液懸浮，得到所述單核細胞懸液。
6.如權利要求5所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：所述兔外周全血與所述樣本稀釋液的體積比為1：1；所述兔外周全血與所述兔淋巴分離液的體積比為1：2；所述兔外周全血與所述無鈣鎂的PBS緩沖液的體積比為10：3。
7.如權
8.如權利要求7所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：所述生物素化抗兔IgG抗體與所述鏈霉素親和磁珠的質量比為20μg︰1mg；所述鏈霉素親和磁珠的質量以步驟(1)所述的單核細胞懸液的體積計為4μg/mL。
9.如權利要求1所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：步驟(2)中，第二次分選為：用無鈣鎂的PBS緩沖液將B淋巴細胞懸液稀釋，至細胞濃度為1×104個/mL-1×106個/mL，利用單細胞儀在單細胞模式下進行分選。
10.如權利要求1所述的單個B淋巴細胞克隆兔IgG重鏈全長基因的方法，其特征在于：步驟(3)中，所述反轉錄的引物為oligo?dT引物。
...【技術特征摘要】
1.一種單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于所述方法包括：
2.如權利要求1所述的單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于所述正向引物為下列之一：
3.如權利要求2所述的單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于：
4.如權利要求3所述的單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于：所述正向引物為13-f，所述反向引物為13-a。
5.如權利要求1所述的單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于：步驟(1)中，所述兔外周全血是經過耳緣抽取的靜脈血；所述兔外周全血用樣本稀釋液進行稀釋后，利用兔淋巴分離液進行密度梯度分離，吸取第二層的淋巴細胞，用無鈣鎂的pbs緩沖液懸浮，得到所述單核細胞懸液。
6.如權利要求5所述的單個b淋巴細胞克隆兔igg重鏈全長基因的方法，其特征在于：所述兔外周全血與所述樣本稀釋液的體積比為1：1；所述兔外周全血與所述兔淋巴分離液的體積比為1：2；所述兔外周全血與所述無鈣鎂的pbs緩沖液的體積比為10：3。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王為民，
申請(專利權)人：銀沙生物科技杭州有限公司，
類型：發明
國別省市：
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