【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)專利涉及一種t7?rna聚合酶突變體及其應(yīng)用，屬于生物。
技術(shù)介紹
1、核糖核酸(rna)是極其重要的生物大分子，在遺傳信息的傳遞中發(fā)揮著重要作用，廣泛存在于自然界中，一直以來是熱門研究領(lǐng)域。近年來，隨著對(duì)rna研究的深入，rna在疾病檢測(cè)和治療方面的作用開始突顯，rna療法興起。rna療法是指使用基于rna的分子來治療或預(yù)防疾病，對(duì)標(biāo)靶特異性高、遺傳毒性低，對(duì)廣泛的遺傳分子和一些罕見疾病具有很高的潛力。隨著mrna新冠疫苗的成功開發(fā)以及其他多種rna新型藥物的獲批，rna藥物躍居藥物研究前沿，對(duì)特定長(zhǎng)度及特定序列的高質(zhì)量rna分子的供給也提出了巨大的挑戰(zhàn)。rna的體外合成主要有化學(xué)法合成和酶法合成兩種方法。化學(xué)法合成主要適用于短鏈rna，對(duì)于長(zhǎng)鏈rna由于合成成本太高，限制了實(shí)用性。而編碼蛋白質(zhì)的mrna通常有幾千個(gè)核苷酸，因此對(duì)于長(zhǎng)鏈mrna，酶法合成是目前的常用及最佳方案。
2、在體外合成長(zhǎng)鏈mrna，一般是用雙鏈dna模板，通過rna聚合酶轉(zhuǎn)錄合成mrna。在這個(gè)過程中，t7?rna聚合酶是最常用的rna聚合酶。t7?rna聚合酶是來源于大腸桿菌t7噬菌體的單亞基rna聚合酶，于上世紀(jì)70年代被鑒定，此后就開始廣泛應(yīng)用于體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和體外rna合成。t7?rna聚合酶一共有883個(gè)氨基酸，約99kda，以雙鏈dna為模板，通過識(shí)別特定的啟動(dòng)子序列，轉(zhuǎn)錄合成mrna。t7?rna聚合酶具有成熟穩(wěn)定的異源表達(dá)純化工藝，且不需要任何其他輔助因子即可正常行使轉(zhuǎn)錄活性，又能夠產(chǎn)生高保真度的全長(zhǎng)rna轉(zhuǎn)錄本，
3、針對(duì)這些問題，本專利技術(shù)提供了一種能在體外合成中獲得更高質(zhì)量rna的t7?rna聚合酶突變體及其應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種t7?rna聚合酶突變體。
2、本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：
3、一種t7?rna聚合酶突變體，為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
4、a1：在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的野生型t7?rna聚合酶的如下一個(gè)或至少兩個(gè)位置發(fā)生氨基酸替換的蛋白質(zhì)：i6、f11、i19、k60、n67、a70、i82、n86、d87、f162、k180、v186、v214、n233、a247、p277、m369、y457、a465、h523、k610、a615、l651、s686、k740、n764；
5、a2：將a1所示的氨基酸序列經(jīng)過除前述突變以外的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的酶活性及功能的蛋白質(zhì)；
6、a3：與a1的蛋白質(zhì)具有90％以上的序列同源性，且酶活性及功能與a1的蛋白質(zhì)基本相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)；
7、a4：將a1-a3中任一所述的氨基酸序列的n端或/和c端連接標(biāo)簽或酶切位點(diǎn)得到的融合蛋白質(zhì)，該標(biāo)簽或酶切位點(diǎn)不影響t7?rna聚合酶突變體的功能。
8、優(yōu)選的，所述t7?rna聚合酶突變體，為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
9、a1：在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的野生型t7?rna聚合酶的如下一個(gè)或至少兩個(gè)位置發(fā)生替換的蛋白質(zhì)：i6、i19、k60、n67、a70、n86、f162、k180、v186、n233、a247、p277、a465、l651、n764；
10、a2：將a1所示的氨基酸序列經(jīng)過除前述突變以外的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的酶活性及功能的蛋白質(zhì)；
11、a3：與a1的蛋白質(zhì)具有90％以上的序列同源性，且酶活性及功能與a1的蛋白質(zhì)基本相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)；
12、a4：將a1-a3中任一所述的氨基酸序列的n端或/和c端連接標(biāo)簽或酶切位點(diǎn)得到的融合蛋白質(zhì)，該標(biāo)簽或酶切位點(diǎn)不影響t7?rna聚合酶突變體的功能。
13、優(yōu)選的，所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：i6g、f11l、i19t、k60i、n67s、a70q或t、i82v、n86d、d87g、f162s、k180e或d、v186i、v214a、n233d、a247t或i、p277l、m369s或t、y457h、a465t、h523r、k610r、a615t、l651m、s686g、k740r、n764d。
14、優(yōu)選的，所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：i6g、f11l、i19t、k60i、n67s、a70q、n86d、f162s、k180e或d、v186i、v214a、n233d、a247i、p277l、m369s、y457h、a465t、h523r、l651m、n764d。優(yōu)選的，為如下b1-b3中任一所述的蛋白質(zhì)：
15、b1：在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的野生型t7?rna聚合酶的基礎(chǔ)上發(fā)生以下任意一種組合的氨基酸替換得到的蛋白質(zhì)：
16、(1)n86d/a615t；
17、(2)f162s；
18、(3)f162s/k180e；
19、(4)a247i；
20、(5)p277l；
21、(6)a70q/f162s/k180e；
22、(7)n233d/a465t；
23、(8)d87g/n233d/v186i；
24、(9)a70t/p277l；
25、(10)n67s/i82v/y457h/k610r/l651m/n764d；
26、(11)f162s/a247t；
27、(12)f162s/n233d/a247t；
28、(13)v214a；
29、(14)i19t/k180d/m369t；
30、(15)f162s/k180e/a247i；
31、(16)a70q/v214a；
32、(17)a465t；
33、(18)f11l；
34、(19)k180e；
35、(20)m369s/s686g；
36、(21)k60i/a465t/k740r；
37、(22)h523r；
38、(23)a70t/k180d；...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：I6G、F11L、I19T、K60I、N67S、A70Q或T、I82V、N86D、D87G、F162S、K180E或D、V186I、V214A、N233D、A247T或I、P277L、M369S或T、Y457H、A465T、H523R、K610R、A615T、L651M、S686G、K740R、N764D。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：I6G、F11L、I19T、K60I、N67S、A70Q、N86D、F162S、K180E或D、V186I、V214A、N233D、A247I、P277L、M369S、Y457H、A465T、H523R、L651M、N764D。
5.根據(jù)權(quán)
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于在突變體的N端連接His標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體，其特征在于，所述突變體與野生型T7?RNA聚合酶相比較，具有更低的dsRNA副產(chǎn)物、更高的產(chǎn)物完整度、更高的產(chǎn)量或轉(zhuǎn)錄活性、更低的帽類似物使用量中的一個(gè)或多個(gè)特性。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體的編碼基因。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體的表達(dá)載體。
10.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體的表達(dá)宿主菌。
11.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體在制備體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄試劑中的應(yīng)用。
12.一種轉(zhuǎn)錄試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體。
13.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體在催化共轉(zhuǎn)錄加帽中的應(yīng)用。
14.一種共轉(zhuǎn)錄加帽試劑盒，包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體，帽類似物和緩沖體系。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖體系包括：30-50mM?Tris、5-20mM?DTT、1-5mM亞精胺、20-100mM?MgCl2。
16.一種方法，其特征在于，包括：將核酸模板與權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體接觸，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括將所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的添加劑接觸，以產(chǎn)生藥物劑型。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括將所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與加帽酶接觸以形成加帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括將所述加帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的添加劑接觸，以產(chǎn)生藥物劑型。
20.一種方法，其特征在于，包括：將核酸模板、帽類似物、權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的T7?RNA聚合酶突變體、緩沖體系接觸，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和加帽，獲得加帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，還包括將所述加帽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與藥學(xué)上可接受的添加劑接觸，以產(chǎn)生藥物劑型。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種t7?rna聚合酶突變體，其特征在于為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于為如下a1-a4中任一所述的蛋白質(zhì)：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：i6g、f11l、i19t、k60i、n67s、a70q或t、i82v、n86d、d87g、f162s、k180e或d、v186i、v214a、n233d、a247t或i、p277l、m369s或t、y457h、a465t、h523r、k610r、a615t、l651m、s686g、k740r、n764d。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于所述氨基酸替換為以下的任意一種或至少兩種的組合：i6g、f11l、i19t、k60i、n67s、a70q、n86d、f162s、k180e或d、v186i、v214a、n233d、a247i、p277l、m369s、y457h、a465t、h523r、l651m、n764d。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于為如下b1-b3中任一所述的蛋白質(zhì)：
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于在突變體的n端連接his標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的t7?rna聚合酶突變體，其特征在于，所述突變體與野生型t7?rna聚合酶相比較，具有更低的dsrna副產(chǎn)物、更高的產(chǎn)物完整度、更高的產(chǎn)量或轉(zhuǎn)錄活性、更低的帽類似物使用量中的一個(gè)或多個(gè)特性。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的t7?rna聚合酶突變體的編碼基因。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉想，唐瓊衛(wèi)，朱思思，胡南南，殷賽男，謝薇，宋東亮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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