【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及無殼(離卵(ex?ovo))卵測定的建立、制備和用途的領域，并且更具體地涉及尿囊絨膜(chorioallantoic?membrane，cam)測定、方法及其用途。本專利技術還涉及用于卵胚胎培養和改造的技術和設備，并且更具體地涉及禽類卵胚胎培養和改造。本專利技術還涉及用于治療尤因肉瘤、橫紋肌肉瘤和肝母細胞瘤的方法。
技術介紹
1、臨床前癌癥研究的范圍為從廉價且不一定反映腫瘤微環境的體外研究到模型更好但在規模上過于昂貴的小鼠研究。先前，已經提出使用雞卵進行的無殼卵測定(參見fisher,“chick?embryos?in?shell-less?culture”,in?tested?studies?for?laboratoryteaching,pp.105-115,proceedings?of?the?5th?workshop/conference?of?theassociation?for?biology?laboratory?education,goldman,et?all,ed.,1993；和2005年4月14日公開的由sierra-honigmann轉讓給cedars-sanai醫學中心的pct公開wo?2005/033300?a1)。采用帶殼卵(包括雞、鴨、火雞、鵝、鵪鶉、雉、松雞、鴕鳥、鴯鹋、食火雞和鷸鴕(kiwi)卵)的測定(參見2010年5月14日公開的chen的pct公開no.wo?2010/054022?a1，其所有均通過引用并入本文)以及采用多種尿囊絨膜(cam)的測定也是已知的。
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3、用于培養禽胚胎的典型方法分為兩大類：卵內(in?ovo)，即在殼上切割小孔洞以接近胚胎(參見例如handler,et?al.,“studies?on?mortality?in?chick?embryosresulting?from?implantation?of?whole?blood?and?blood?fractions?from?patientsand?animals?with?neoplastic?disease”,proc?natl?acad?sci?u?s?a,vol.48,pp.1549-73(1962)，其通過引用并入本文)，以及離卵，其將胚胎轉移至容器(例如細胞培養板)并與殼分離生長。雖然卵內孵育雞的方法對雞存活有效，但其耗時且由于需要熟練的操作者而不能規模化(參見deryugina&quigley,“chick?embryo?chorioallantoic?membrane?modelsystems?to?study?and?visualize?human?tumor?cell?metastasis”,histochem?cellbiol?vol.130,pp.1119-30(2008)，其通過引用并入本文)。對于離卵方法，另一組報道了用于日本鵪鶉的培養方法，該方法是新的但也費時且不適合在多孔板中自動化(參見subauste,et?al.,“evaluation?of?metastatic?and?angiogenic?potentials?of?humancolon?carcinoma?cells?in?chick?embryo?model?systems”,clin?exp?metastasisvol.26,pp.1033-47(2009)和kato,et?al.,“culture?system?for?bobwhite?quailembryos?from?the?blastoderm?stage?to?hatching”,j?poultry?sci,pp.155-58(2013)，二者均通過引用并入本文)。
4、使用禽卵和/或cam測定的方法具有臨床前藥物施用(給藥)藥代動力學挑戰，但近年來已通過表面和靜脈內注射(vargas,et?al.,“the?chick?embryo?and?itschorioallantoic?membrane(cam)for?the?in?vivo?evaluation?of?drug?deliverysystems”,adv?drug?deliv.rev.vol.59,pp.1162-76(2007)，其通過引用并入本文)以及甚至腹膜內的方法將藥物施加到鵪鶉或雞中。這樣的方法同樣由于需要熟練的操作者進行注射而無法使其本身自動化。
5、另外，已經發現表面施加以及甚至注射可不產生精確濃度的遞送的藥物或化合物。已經發現，在表面施加中，藥物可被未知且不同的程度稀釋，并且還可在胚胎中不均勻地擴散。
6、由于禽胚胎培養物不是免疫妥協的而是免疫耐受的，因此可對多種癌癥進行cam實驗。然而，已知的cam方法是非常低通量的，因為需要相當的技術人員專業知識，并且存在顯著的技術人員間的可變性。因此，本專利技術人不知曉任何中通量或高通量cam制備方法，也不知曉用于分析成人或小兒癌癥的報道的任何中通量或高通量cam測定。參見例如通過可從inovation,la?tronche,france獲得的雞胚胎的cam(https://www.inovotion.com/our-technology/a-unique-in-vivo-technology)，其采用需要大量人工操作和制備的卵內測定。這是因為對于已知的離卵cam測定，轉移具有完整卵黃的受精卵內容物以維持胚胎生存力的技術困難導致了限速步驟。迄今為止，這樣的步驟需要熟練的技術人員小心地進行轉移，并且即使是訓練有素的技術人員也會導致顯著的破損和變化，所有這些都會降低通量、速度和可靠性。
7、在例如abraham,et?al.“evasion?mechanisms?to?igf1r?inhibition?inrhabdomyosarcoma”,mol.cancer?there.,vol.10,pp.697-707(2011)中，還已知cam測定在3d支架上培養腫瘤細胞并檢測藥物效力。在本文中，將受精鵪鶉卵洗滌、干燥、滅菌，并在37.4℃下孵育3天(e3)。用鑷子去除小部分卵殼，并將卵的內容物轉移至6孔板的孔中。在e6時，將在3d支架(3d?biotek)上生長的1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.用于預定數目的卵的開卵器，其包含：
2.根據前述權利要求中任一項所述的開卵器，其中所述預定數目的卵保持器各自被定尺寸以保持選自以下的卵：禽卵；或雞卵、鵪鶉卵及其組合；或鵪鶉卵；或日本鵪鶉(Coturnix?japonica)卵。
3.用于制備離卵腫瘤異種移植物的方法，其包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的用于制備離卵腫瘤異種移植物的方法，其還包括在將所述注有細胞的介質添加至所述CAM之前將所述注有細胞的介質添加至支架的步驟。
5.用于測試治療性化合物的測定，其包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的用于測試治療性化合物的測定，其還包括以下步驟：
7.用于通過離卵鵪鶉卵異種移植物測定來測試治療性化合物的方法，其包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述的用于通過離卵鵪鶉卵異種移植物測定來測試治療性化合物的方法，其中所述多個細胞是腫瘤細胞；或肝癌細胞；或肝母細胞瘤細胞；或HepG2人肝肝母細胞瘤癌細胞(ATCC?HB-8065)；或尤因肉瘤細胞，或HB234細胞；或HB282細胞；或橫紋肌肉瘤細胞
9.根據權利要求8所述的用于通過離卵鵪鶉卵異種移植物測定來測試治療性化合物的方法，其還包括分析所述實驗性數據的步驟。
10.用于治療尤因肉瘤的方法，其包括向患者施用有效量的VEGFR抑制劑、聚激酶抑制劑、EGFR抑制劑、及其組合；或西地尼布、厄洛替尼、及其組合的步驟。
11.用于治療橫紋肌肉瘤的方法，其包括向患者施用有效量的PI3K/mTOR抑制劑及其組合；或BEZ235的步驟。
12.用于治療肝母細胞瘤的方法，其包括向患者施用有效量的PLK抑制劑及其組合；或PLK1、伏拉色替及其組合的步驟。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.用于預定數目的卵的開卵器，其包含：
2.根據前述權利要求中任一項所述的開卵器，其中所述預定數目的卵保持器各自被定尺寸以保持選自以下的卵：禽卵；或雞卵、鵪鶉卵及其組合；或鵪鶉卵；或日本鵪鶉(coturnix?japonica)卵。
3.用于制備離卵腫瘤異種移植物的方法，其包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的用于制備離卵腫瘤異種移植物的方法，其還包括在將所述注有細胞的介質添加至所述cam之前將所述注有細胞的介質添加至支架的步驟。
5.用于測試治療性化合物的測定，其包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的用于測試治療性化合物的測定，其還包括以下步驟：
7.用于通過離卵鵪鶉卵異種移植物測定來測試治療性化合物的方法，其包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述的用于通過離卵鵪鶉卵異種移植物測定來測試治療性化合物的方法，其中所述多個細胞是腫...
【專利技術屬性】
技術研發人員：查爾斯·凱勒三世，塞繆爾·瓦爾·拉斯穆森，
申請(專利權)人：兒童癌癥治療發展研究所，
類型：發明
國別省市：
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