【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物，尤其涉及一種大腸桿菌噬菌體包埋方法及其應用。
技術介紹
1、雞氣囊炎屬于呼吸道疾病，是由于呼吸道感染導致氣囊出現癥狀。氣囊炎臨床上最常見的是大腸桿菌(escherichia?coli)感染引起的氣囊炎：通常病雞精神沉郁，呼吸困難，有啰音，咳嗽；剖檢可見氣囊混濁，有大量混濁的滲出液，重者氣囊壁增厚，有大小不等的干酪樣凝塊。當氣囊出現病變時，表明已經到達臨界點，機體已經發生嚴重的呼吸系統疾病，隨時可能有病原微生物侵入胸腹，造成發病雞群的高死亡率，且只要雞群發病就會表現出嚴重癥狀，病程持續時間長、治療難度大。
2、由于氣囊結構特殊，氣囊壁非常薄，且分布極少的血管，且血管內的藥物基本無法達到足夠高的濃度，采取常規方法給藥都不會有理想的效果。
3、噬菌體是感染細菌、真菌等微生物的病毒，噬菌體治療細菌性疾病具有很多優勢。代謝效率低、殺死細菌的最低劑量低、高度的特異性、高效的殺菌效果、克服細菌抗性的能力強、新型有效的噬菌體的篩選速度快。相比于抗生素治療，使用噬菌體方法進行治療更有效，且具有良好的生物安全性。但是，現有技術中將噬菌體進行包埋制備得到預防或治療雞氣囊炎的藥物尚未見報道。
4、然而，噬菌體作為一種具有蛋白質外殼的活微生物，其活性和作用易受其他因素的影響。因此，噬菌體在使用過程中面臨諸多挑戰。
5、通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：現有技術中將噬菌體進行包埋進而制備得到預防或治療雞氣囊炎的藥物尚未見報道。
技術實現思路p>
1、為克服相關技術中存在的問題，本專利技術公開實施例提供了一種大腸桿菌噬菌體包埋方法及其應用，具體涉及一種大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎的藥物中的應用。
2、所述技術方案如下：本專利技術是這樣實現的，一種大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎的藥物中的應用，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的劑量為107-109pfu/ml。
3、進一步，大腸桿菌噬菌體命名為rdp-ec-22027，于2022年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.45356，分類命名為：大腸桿菌噬菌體，檢測結果為存活。
4、進一步，大腸桿菌噬菌體rdp-ec-22027的核苷酸序列為seq?id?no.1～seq?idno.7所示。
5、進一步，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的制備為：
6、利用海藻酸鈉、二羥基磷脂酸、磷酸鈣緩沖液中的膽固醇和cacl2，減壓旋轉，加入噬菌體，進行水浴超聲處理，完成噬菌體包埋，形成噬菌體脂質體。
7、進一步，55℃減壓旋轉，加入1.6×1013pfu噬菌體。
8、進一步，噬菌體原液濃度為1.6×1010pfu/ml，包埋后的脂質體懸液中未被包埋的噬菌體的濃度為1.12×109pfu/ml。
9、進一步，致病性大腸桿菌的分離方法包括：
10、獲取致病性大腸桿菌樣本，在大腸桿菌顯色選擇性培養基上劃線，37℃培養18-24h后，在培養基上形成藍色菌落，繼續劃線純化至均為藍色的菌落，37℃、200rpm振蕩培養4-6h，制備細菌懸浮液；通過16s?rrna分子鑒定和系統進化型鑒定，確定為致病性大腸桿菌，命名為ec-22027，于-80℃冰箱保存。
11、進一步，噬菌體rdp-ec-22027的分離方法包括：
12、取菌懸液和養殖場污水濾出液加入lb肉湯中，37℃，200rpm振蕩培養過夜，10000rpm離心5min，將上清液用0.22μm濾器過濾，濾出液備用；
13、采用雙平板法進行噬菌體的分離，取宿主大腸桿菌菌懸液與0.7％的軟瓊脂混合均勻鋪在lb平板上，待軟瓊脂凝固后將濾出液點到平板上，靜放至混合液吸收；置于37℃培養箱培養6-8h后，用接種環挑取透明斑于sm緩沖液中，4℃保存過夜，待噬菌體完全釋放，得到噬菌體。
14、進一步，噬菌體rdp-ec-22027的純化方法包括：
15、采用雙平板法進行噬菌體的分離，取混合菌懸液濾出液和宿主大腸桿菌菌懸液混合均勻，加入冷卻至50℃的軟瓊脂混合均勻后鋪雙平板；置于37℃培養箱培養6-8h后，挑取邊緣光滑的單個透明斑于sm緩沖液中，4℃過夜保存；取過夜保存的浸出液和菌懸液混合，加入冷卻至50℃的軟瓊脂混合均勻，鋪雙平板，置于37℃培養箱培養4-6h純化得到噬菌體，命名為rdp-ec-22027。
16、結合上述的所有技術方案，本專利技術所具備的優點及積極效果為：本專利技術將噬菌體制成脂質體，可更快速的到達病灶并可在體內停留更長時間，具有很好的控釋性，可提高保護率、降低死亡率；經過包埋得到的噬菌體脂質體，更有利于對因大腸桿菌感染導致的雞氣囊炎起更好的治療作用，延長保護作用。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的劑量為107-109PFU/mL。
2.根據權利要求1所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體命名為RDP-EC-22027，于2022年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?No.45356，分類命名為：大腸桿菌噬菌體，檢測結果為存活。
3.根據權利要求2所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體RDP-EC-22027的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.7所示。
4.根據權利要求1所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的制備為：
5.根據權利要求4所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在
6.根據權利要求4所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，噬菌體原液濃度為1.6×1010PFU/mL。
7.根據權利要求4所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，包埋后的脂質體懸液中未被包埋的噬菌體的濃度為1.12×109PFU/mL。
8.根據權利要求1所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，致病性大腸桿菌的分離方法包括：
9.根據權利要求2所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，噬菌體RDP-EC-22027的分離方法包括：
10.根據權利要求2所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，噬菌體RDP-EC-22027的純化方法包括：
...【技術特征摘要】
1.一種大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的劑量為107-109pfu/ml。
2.根據權利要求1所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體命名為rdp-ec-22027，于2022年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.45356，分類命名為：大腸桿菌噬菌體，檢測結果為存活。
3.根據權利要求2所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體rdp-ec-22027的核苷酸序列為seq?id?no.1～seq?id?no.7所示。
4.根據權利要求1所述大腸桿菌噬菌體脂質體包被液在制備預防和/或治療雞氣囊炎藥物中的應用，其特征在于，大腸桿菌噬菌體脂質體包被液的制備為：
5.根據權利要求4所述大腸桿菌噬菌體脂質...
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜新永，劉長太，崔翠，騰雨晴，宋新慧，
申請(專利權)人：青島潤達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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