【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及醫(yī)藥，具體是用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組、試劑盒及方法。
技術(shù)介紹
1、新疆出血熱病毒(xhf)是新疆出血熱的病原體，歸類于布尼亞病毒目(bunyavirales)的內(nèi)羅病毒科(nairoviridae)正內(nèi)羅病毒屬，克里米亞-剛果出血熱物種(cchfv)。病毒呈球形或橢圓形，其結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)特性和抵抗力與漢坦病毒相似，但抗原性不同。小白鼠乳鼠對此病毒高度易感，可用于病毒分離和傳代。
2、《新疆出血熱病毒分子流行病學(xué)研究》一文中提到，rtpcr檢測2001-2002年xhf患者和蜱標(biāo)本中xhf病毒s基因，陽性標(biāo)本直接進行核苷酸序列測定。計算機軟件進行s基因部分片段和s全基因序列同源性比較和s基因、m基因的種系發(fā)生樹分析。結(jié)果不同年份人和蜱來源的病毒s基因部分片段核苷酸序列均顯示較高同源性(97.3％～100％)。s基因進化樹分析將病毒分成了歐洲、非洲和亞洲3組,其中亞洲毒株由中亞分離株和中國分離株組成,中國所有的xhf病毒s基因(同源性93.0％～99.5％)均集中在一個分枝下形成獨立的一組，明顯區(qū)別于世界上其他地區(qū)分離株(同源性81.40％～96.4％)。m基因進化樹分析表明序列間差異不完全與病毒分離的地理區(qū)域相關(guān)。結(jié)論s基因分析顯示xhf病毒蜱分離株與人分離株遺傳背景接近,我國xhf病毒有共同的進化途徑和基因結(jié)構(gòu)特點，并具明顯的地域性。
3、xhfv的檢測方法，在實踐工作中可根據(jù)不同的需要和現(xiàn)場(實驗室)的具體條件選擇不同的方法：1.早期快速檢出病毒抗原：從急性期病人末梢血液中檢測循環(huán)
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組、試劑盒及方法，對于優(yōu)化新疆出血熱病毒的臨床篩查或科學(xué)研究，具有重要的意義和應(yīng)用價值。
2、為達此目的，本專利技術(shù)提供如下的技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)的第一個方面，提供了一種用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組，包括正向引物序列seq?id?no.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seq?id?no.7；
4、f2(seq?id?no.5)：agacatggacattgtagcctctga；
5、r2(seq?id?no.6)：cattgtaggcattttggaatgga；
6、p2(seq?id?no.7)：ctgctacaccaatcccttgtcggca。
7、優(yōu)選的，在反應(yīng)體系中，正向引物序列、反向引物序列或探針序列的濃度均為0.2-0.3μmol/l。
8、本專利技術(shù)的第二個方面，提供了一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，包括正向引物序列seq?id?no.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seq?id?no.7。
9、優(yōu)選的，還包括5*buffer、mg2+、dntp、taq酶和逆轉(zhuǎn)錄體系。
10、優(yōu)選的，正向引物序列seq?id?no.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seqid?no.7的初始濃度均為10um。
11、本專利技術(shù)的第三個方面，提供了一種非診斷目的檢測新疆出血熱病毒的方法，包括以下步驟：
12、s1、提取樣本總dna；
13、s2、加入5*buffer、mg2+、dntp、taq酶、逆轉(zhuǎn)錄體系、水、正向引物、反向引物和探針，其中，正向引物序列seq?id?no.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seq?id?no.7的濃度均為10um；
14、s3、將反應(yīng)體系進行qpcr擴增。
15、優(yōu)選的，步驟s2中，正向引物序列、反向引物序列或探針序列的終濃度均為0.2-0.3μmol/l。
16、優(yōu)選的，步驟s3中，qpcr擴增的反應(yīng)條件為：熱蓋100-105℃、逆轉(zhuǎn)錄40-42℃、預(yù)熱90-95℃、變性90-95℃、退火55-60℃、延伸70-72℃，變性、退火和延伸共循環(huán)40次。
17、優(yōu)選的，步驟s2中的反應(yīng)體系為5*buffer?5ul、mg2+1.25ul、dntp?0.5ul、f引物(10um)0.75ul、r引物(10um)0.75ul、探針(10um)0.75ul、taq酶0.35ul、逆轉(zhuǎn)錄體系1ul、h2o10.4ul、樣本5ul。
18、優(yōu)選的，步驟s3中，qpcr擴增的反應(yīng)條件為：
19、
20、循環(huán)變性、退火和延伸共循環(huán)40次。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)有益效果及顯著進步在于：本專利技術(shù)篩選了大量用于檢測新疆出血熱病毒的引物組，最終篩選出了擴增效率為114.655％、擁有更為標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線、更高的靈敏度和低限檢測的引物組。
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1.一種用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組，其特征在于，包括正向引物序列SEQID?NO.5、反向引物序列SEQ?ID?NO.6和探針序列SEQ?ID?NO.7。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組，其特征在于，在反應(yīng)體系中，正向引物序列、反向引物序列或探針序列的濃度均為0.2-0.3μmol/L。
3.一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，其特征在于，包括正向引物序列SEQ?IDNO.5、反向引物序列SEQ?ID?NO.6和探針序列SEQ?ID?NO.7。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，其特征在于，還包括5*buffer、Mg2+、dNTP、Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄體系。
5.如權(quán)利要求3所述的一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，其特征在于，正向引物序列SEQ?ID?NO.5、反向引物序列SEQ?ID?NO.6和探針序列SEQ?ID?NO.7的初始濃度均為10uM。
6.一種非診斷目的檢測新疆出血熱病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權(quán)利要求6所述的一種
8.如權(quán)利要求6所述的一種非診斷目的檢測新疆出血熱病毒的方法，其特征在于，步驟S3中，qPCR擴增的反應(yīng)條件為：熱蓋100-105℃、逆轉(zhuǎn)錄40-42℃、預(yù)熱90-95℃、變性90-95℃、退火55-60℃、延伸70-72℃，變性、退火和延伸共循環(huán)40次。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組，其特征在于，包括正向引物序列seqid?no.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seq?id?no.7。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于檢測新疆出血熱病毒的高效引物組，其特征在于，在反應(yīng)體系中，正向引物序列、反向引物序列或探針序列的濃度均為0.2-0.3μmol/l。
3.一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，其特征在于，包括正向引物序列seq?idno.5、反向引物序列seq?id?no.6和探針序列seq?id?no.7。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于檢測新疆出血熱病毒的試劑盒，其特征在于，還包括5*buffer、mg2+、dntp、taq酶和逆轉(zhuǎn)錄體系。
5.如權(quán)利要求3所述的一種...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：譚淼，馬小娟，龍翔，袁青，
申請(專利權(quán))人：蘇州海苗生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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