【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于核酸適體篩選，具體而言，涉及一種核酸適體單輪篩選的方法及篩選系統(tǒng)。
技術(shù)介紹
1、核酸適體是一種短的單鏈dna或rna分子，通過折疊成三級結(jié)構(gòu)，能夠以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)。由于其在治療、藥物輸送、診斷、功能基因組學(xué)和生物傳感的多種應(yīng)用潛力而引起了廣泛的研究興趣。然而，從包含大約1014到1015個分子的文庫中嚴(yán)格選擇適體是一個巨大的挑戰(zhàn)。
2、常用的核酸適體選擇方法采用了包括孵育、分離和擴(kuò)增在內(nèi)的富集迭代過程。這些方法通常需要8到15輪富集周期，每輪富集周期都需要進(jìn)行孵育、分離、洗脫和擴(kuò)增等多個步驟，每輪周期將候選核酸適體的數(shù)量減少大約一個數(shù)量級。這一過程有幾個挑戰(zhàn)，包括pcr偏好擴(kuò)增，無效分離等，導(dǎo)致有些具有較好親和力的核酸適體，由于pcr擴(kuò)增時沒有順利擴(kuò)增，或是沒有被順利分離出來，從而被遺漏。同時對于篩選得到的核酸適體表征效率低也是一個很重要的限制因素。因此，目前的核酸適體選擇方法既耗時又費(fèi)力，成本高昂，而且無法保證獲得高親和力的適體。
3、為了推進(jìn)核酸適體選擇過程，研究了許多替代方法，包括基于微珠的選擇、基于毛細(xì)管電泳的選擇、基于微流體的選擇以及引入高通量測序技術(shù)等。為了盡可能的減少篩選輪次，研究人員開發(fā)了單輪篩選方法。2005年的non-selex技術(shù)是一種借鑒了毛細(xì)管電泳技術(shù)的單輪篩選方法，這種方法受上樣量的限制，只能使用1012左右的文庫，且操作復(fù)雜，只能篩選出少數(shù)容易篩選蛋白的核酸適配體。2009年開發(fā)的m-selex技術(shù)，基于微流控技術(shù)單輪篩選得到了與重組肉毒桿菌神經(jīng)毒素
4、盡管這些單輪篩選方法在改善核酸適體選擇方面取得了一定進(jìn)展，但他們的實(shí)用性、可轉(zhuǎn)移性以及可能的可靠性仍然受到很大的限制，并且核酸適體結(jié)合仍然以連續(xù)方式表征，每個候選適體的親和力和特異性需要單獨(dú)測量。因此，為了真正加速核酸適體的發(fā)現(xiàn)和篩選，有必要專利技術(shù)一種高度實(shí)用且易于采用的核酸適體單輪篩選方法，從而實(shí)現(xiàn)快速篩選適體并且能以大規(guī)模并行方式對大量適體進(jìn)行結(jié)合表征。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種核酸適體單輪篩選方法及篩選系統(tǒng)，通過將一輪篩選裝置、乳液pcr或液滴數(shù)字rcr裝置，以及高通量測序系統(tǒng)裝置組合使用，在一輪篩選、一次擴(kuò)增之后，利用高通量測序系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高通量測序并原位表征每條序列與靶標(biāo)的結(jié)合性能，從而篩選出結(jié)合靶標(biāo)的高親和力核酸適體。該方法能從初始隨機(jī)核酸文庫中，僅需通過一輪篩選，一輪擴(kuò)增，即可獲得靶標(biāo)的高親和力核酸適體，具有快速，高效，低成本的特點(diǎn)，同時能夠以大規(guī)模并行的方式對大量適體進(jìn)行結(jié)合表征，可以廣泛應(yīng)用于各種靶標(biāo)的核酸適體篩選，具有徹底改變核酸適體篩選方式的巨大潛力。
2、一方面，一種核酸適體單輪篩選的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3、(1)經(jīng)一輪篩選，獲得能與靶標(biāo)結(jié)合的富集文庫；所述一輪篩選的過程無需進(jìn)行擴(kuò)增；
4、(2)將富集文庫進(jìn)行擴(kuò)增放大，制備單鏈文庫；
5、(3)通過高通量測序系統(tǒng)對單鏈文庫進(jìn)行測序，并使單鏈文庫中的每條序列與靶標(biāo)在高通量測序系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行原位結(jié)合表征，挑選出結(jié)合靶標(biāo)的高親和力核酸適體。
6、本專利技術(shù)提供的核酸適體單輪篩選方法，先將核酸文庫與靶標(biāo)孵育，經(jīng)過幾次分離洗脫，獲得一輪篩選后的富集文庫；接著將富集文庫進(jìn)行擴(kuò)增放大，制備單鏈文庫；將單鏈文庫建庫，經(jīng)過高通量測序系統(tǒng)獲得序列信息，并原位對文庫中每條序列與靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合表征，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，挑選候選適體，合成驗(yàn)證親和力，實(shí)現(xiàn)核酸適體的單輪篩選。
7、在此解釋兩個概念：單輪篩選和一輪篩選，這是兩個不同的概念?？梢岳斫獾氖?，核酸適體單輪篩選，是指篩選過程中只進(jìn)行一輪篩選，一次擴(kuò)增；而一輪篩選是指篩選過程無需擴(kuò)增，僅僅在制備成單鏈文庫后才進(jìn)行一次擴(kuò)增，篩選過程中，將與靶標(biāo)結(jié)合和不結(jié)合的序列進(jìn)行分離的具體次數(shù)可以是一次也可以是多次。
8、常規(guī)的核酸適體篩選過程(如selex篩選)需要多輪篩選，每一輪都需要孵育、分離、洗脫和擴(kuò)增過程，非常繁瑣。而采用本專利技術(shù)提供的單輪篩選方法，可以是針對經(jīng)過一次結(jié)合分離的篩選結(jié)果直接建庫，也可以是經(jīng)過多次結(jié)合分離的篩選結(jié)果縮小庫容量后再建庫，每次結(jié)合分離期間都無需擴(kuò)增，只需要最后獲得富集文庫后，再進(jìn)行一次擴(kuò)增即可。
9、所述的高通量測序系統(tǒng)為第二代高通量測序設(shè)備(genolab?m基因測序儀，深圳市真邁生物科技有限公司)，該系統(tǒng)中設(shè)有用于高通量測序的測序芯片，當(dāng)含有核酸序列的溶液通入測序芯片時，能被芯片表面的序列捕獲，通過橋式pcr生成單克隆dna簇，再加入不同熒光標(biāo)記的堿基依次檢測序列的堿基排序，最后獲得序列信息達(dá)到測序的目的。
10、本專利技術(shù)在利用該測序芯片完成測序后，直接向測序芯片中通入靶標(biāo)溶液，使每條序列在測序芯片中與靶標(biāo)進(jìn)行原位結(jié)合表征。由于靶標(biāo)溶液中的靶標(biāo)帶有熒光標(biāo)記，與靶標(biāo)有結(jié)合的序列就會帶上熒光標(biāo)記，與靶標(biāo)沒有結(jié)合的序列就沒有熒光標(biāo)記，這樣就可以通過熒光的有無判斷序列與靶標(biāo)的結(jié)合能力。同時因?yàn)槊糠N序列在測序芯片上的數(shù)量接近，因此與靶標(biāo)的接觸機(jī)會相近，那么與靶標(biāo)結(jié)合越多的序列其結(jié)合靶標(biāo)的能力也就越強(qiáng)，從而可以直接在測序芯片中根據(jù)序列與靶標(biāo)的結(jié)合數(shù)量判斷哪些序列與靶標(biāo)的親和力更高，迅速找到與靶標(biāo)具有更高親和力的核酸適體。這種單輪篩選方法徹底改變了過去的篩選方式，操作過程更加便利，時間更短，成本更低，顯著提高篩選效率，同時還大幅提高了篩選成功率。
11、本專利技術(shù)將傳統(tǒng)的高通量測序技術(shù)系統(tǒng)擴(kuò)展到分子間相互作用(核酸適體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合力)的研究，利用現(xiàn)有的集成化平臺，實(shí)現(xiàn)了核酸適體的單輪篩選，能夠同時測量數(shù)百萬個核酸序列的親和力，為該領(lǐng)域提供了強(qiáng)大的研究工具，具有徹底改變核酸適體篩選方法的巨大潛力。
12、進(jìn)一步地，步驟(2)所述擴(kuò)增的方法為pcr、乳液pcr、液滴數(shù)字rcr中的任意一種或多種，所述擴(kuò)增的次數(shù)為一次。
13、在一些方式中，步驟(2)所述擴(kuò)增的方法優(yōu)選為乳液pcr或液滴數(shù)字rcr。
14、常規(guī)的核酸適體過程需要多輪篩選，每一輪都需要孵育、分離和擴(kuò)增等步驟，擴(kuò)增采用的是普通的pcr方法，也就是說需要多次pcr擴(kuò)增。普通pcr在對大量序列同時擴(kuò)增時，由于存在pcr偏好的問題，導(dǎo)致有些序列不易擴(kuò)增從而會影響富集程度進(jìn)而導(dǎo)致高親和力適體可能丟失。
15、本專利技術(shù)采用乳液pcr或液滴數(shù)字rcr，可以擴(kuò)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種核酸適體單輪篩選的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述擴(kuò)增的方法乳液PCR或液滴數(shù)字RCR，所述擴(kuò)增的次數(shù)為一次。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述高通量測序系統(tǒng)包括測序芯片和檢測裝置；所述測序芯片用于生成每條序列的DNA簇，每個DNA簇在芯片上有一個物理位置，當(dāng)通入靶標(biāo)溶液后，靶標(biāo)與每個DNA簇進(jìn)行原位結(jié)合表征；所述檢測裝置先用于檢測每條序列的位置信息和堿基排序，再用于檢測每條序列結(jié)合靶標(biāo)的能力，從而找出與靶標(biāo)結(jié)合的高親和力核酸適體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述測序芯片設(shè)有進(jìn)液口和出液口；當(dāng)檢測裝置用于檢測每條序列的位置信息和堿基排序時，需向測序芯片通入測序緩沖液，當(dāng)檢測裝置用于檢測每條序列結(jié)合靶標(biāo)的能力時，需向測序芯片通入含有靶標(biāo)的結(jié)合緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液包括含Mg2+的DPBS。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶標(biāo)為蛋白、小分子、多肽、寡肽、小肽、核酸或酶分子
7.一種核酸適體單輪篩選系統(tǒng)，其特征在于，包括一輪篩選裝置、擴(kuò)增裝置和高通量測序系統(tǒng)裝置；
8.高通量測序系統(tǒng)用于制備能夠?qū)崿F(xiàn)核酸適體單輪篩選的系統(tǒng)的用途，其特征在于，所述高通量測序系統(tǒng)包括測序芯片和檢測裝置，所述測序芯片用于生成每條序列的DNA簇，每個DNA簇在芯片上有一個物理位置，當(dāng)通入靶標(biāo)溶液后，靶標(biāo)與每條序列進(jìn)行原位結(jié)合表征；所述檢測裝置先用于檢測每條序列的位置信息和堿基排序，再用于檢測每條序列結(jié)合靶標(biāo)的能力，從而找出與靶標(biāo)結(jié)合的高親和力核酸適體；所述核酸適體單輪篩選是指篩選過程只需一輪篩選、一次擴(kuò)增即可篩選獲得核酸適體的篩選方法。
9.一種高通量測定核酸適體親和力的方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.一種OX40蛋白的核酸適體，其特征在于，具有如序列表SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種核酸適體單輪篩選的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述擴(kuò)增的方法乳液pcr或液滴數(shù)字rcr，所述擴(kuò)增的次數(shù)為一次。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述高通量測序系統(tǒng)包括測序芯片和檢測裝置；所述測序芯片用于生成每條序列的dna簇，每個dna簇在芯片上有一個物理位置，當(dāng)通入靶標(biāo)溶液后，靶標(biāo)與每個dna簇進(jìn)行原位結(jié)合表征；所述檢測裝置先用于檢測每條序列的位置信息和堿基排序，再用于檢測每條序列結(jié)合靶標(biāo)的能力，從而找出與靶標(biāo)結(jié)合的高親和力核酸適體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述測序芯片設(shè)有進(jìn)液口和出液口；當(dāng)檢測裝置用于檢測每條序列的位置信息和堿基排序時，需向測序芯片通入測序緩沖液，當(dāng)檢測裝置用于檢測每條序列結(jié)合靶標(biāo)的能力時，需向測序芯片通入含有靶標(biāo)的結(jié)合緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液包括含mg2+的dpbs。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：譚蔚泓，張展豪，羅昭鋒，方曉娜，韋達(dá)，李曉林，金歡，劉磊，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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