【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及功能化合物合成領(lǐng)域，具體涉及麥角硫因的合成方法。
技術(shù)介紹
1、麥角硫因(2-巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽，l-ergothioneine，簡稱egt)是一種稀有的天然手性氨基酸衍生物，有硫酮和硫醇兩種異構(gòu)體形式，在生理ph值下，多以硫酮的形式存在。大量研究表明，麥角硫因是一種高效天然抗氧化劑，可清除活性氧族，螯合二價(jià)金屬離子，激活抗氧化物酶，抑制超氧化物歧化酶，抑制各種血紅素蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)等，兼具抗炎、抗衰老、保護(hù)心血管、提高免疫功能等多種作用。鑒于其獨(dú)特的生物學(xué)功能，麥角硫因在醫(yī)藥、化妝品、功能食品等領(lǐng)域均有廣泛的用途和市場前景。然而工業(yè)上一直難以實(shí)現(xiàn)麥角硫因的大規(guī)模生產(chǎn)，導(dǎo)致其價(jià)格一直居高不下，進(jìn)而極大限制了麥角硫因的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
2、目前麥角硫因的制備方法包括化學(xué)合成法、生物提取法、生物發(fā)酵法和酶催化法。化學(xué)合成法主要以l-組氨酸甲酯為原料，需反復(fù)進(jìn)行官能團(tuán)選擇性保護(hù)及脫保護(hù)，制備工藝繁瑣，環(huán)境成本高，并且合成過程極易發(fā)生外消旋作用，產(chǎn)品的安全性和產(chǎn)率難以保證。生物提取法是從食用菌的子實(shí)體、豬血、動(dòng)物組織、麥角和谷物中提取麥角硫因，但這些原料往往存在較多雜質(zhì)，麥角硫因含量低，提取成本高。以食用菌菌絲深層發(fā)酵技術(shù)制備麥角硫因，同樣存在產(chǎn)率低、純化困難、生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高等問題。隨著綠色可持續(xù)觀念日益深入人心，酶催化技術(shù)作為綠色化學(xué)的重要分支也在逐日興起。由于酶的專一性，以酶法制備麥角硫因可有效減少副反應(yīng)，提高產(chǎn)率，保證產(chǎn)品安全性。seebeck研究表明，將生物體內(nèi)麥角硫因egt系列合成酶異源重組
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題在于提供麥角硫因的合成方法。
2、本專利技術(shù)提供了變體亞砜合成酶，其通過對來源于mycobacterium?smegmatis的亞砜合成酶的氨基酸序列中4個(gè)氨基酸突變，獲得了本專利技術(shù)所述的變體亞砜合成酶，其氨基酸序列如seq?id?no:1所示，其具有較高的催化效率。
3、本專利技術(shù)提供了編碼所述變體亞砜合成酶的核酸，其核苷酸序列如seq?id?no:4所示。
4、本專利技術(shù)提供了組合酶，其包括氨基水解酶，c-s裂解酶和/或本專利技術(shù)所述的變體亞砜合成酶。
5、進(jìn)一步的，所述氨基水解酶來源于micromonospora?rosaria，其氨基酸序列如seqid?no:2所示；所述c-s裂解酶來源于geodermatophilus?sp，其氨基酸如seq?id?no:3所示。
6、本專利技術(shù)所述氨基水解酶和c-s裂解酶第一次被異源表達(dá)用于麥角硫因的合成。它們用于麥角硫因的合成，具有高催化效率。且所述氨基水解酶和c-s裂解酶用于麥角硫因的合成，其源自含有其各自異源表達(dá)宿主的破碎上清，相較于商業(yè)化的商品酶，此方法制得的酶的活力較高，成本較低、酶活性相對較穩(wěn)定。
7、本專利技術(shù)提供了核酸，其包括如下i)～iii)所示中的至少一種：
8、i)、編碼本專利技術(shù)所述的亞砜合成酶變體的核酸，其具有如seq?id?no:4所示的核苷酸序列；
9、ii)、編碼所述氨基水解酶的核酸，其具有如seq?id?no:5所示的核苷酸序列；
10、iii)、編碼所述c-s裂解酶的核酸，其具有如seq?id?no:6所示的核苷酸序列。
11、本專利技術(shù)所述的核酸可以是dna、rna、cdna或pna。在本專利技術(shù)實(shí)施例中，所述核酸為dna形式。所述dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。所述dna可以是單鏈的或是雙鏈的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如編碼區(qū)和非編碼區(qū)如調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止子)。核酸在拓?fù)鋵W(xué)上可以是線性或環(huán)狀的。核酸可以是例如載體(如表達(dá)或克隆載體)的一部分，或一個(gè)片段。所述核酸可直接從天然來源獲得，或者可由重組、酶法或化學(xué)技術(shù)輔助制備。所述rna形式為由基因轉(zhuǎn)錄獲得的mrna等。
12、本專利技術(shù)提供了所述核酸的表達(dá)模塊，其包括：啟動(dòng)子、終止子和本專利技術(shù)所述的核酸。
13、本專利技術(shù)中，所述的表達(dá)模塊還包括單個(gè)或多個(gè)本專利技術(shù)所述的核酸以串聯(lián)、融合表達(dá)或及其他可行方式組合形成的表達(dá)模塊，本專利技術(shù)對此不做限定。
14、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)中還提供了所述核酸的轉(zhuǎn)錄單元，所述轉(zhuǎn)錄單元是指啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的dna序列。啟動(dòng)子和終止子兩側(cè)或之間還可包括調(diào)控片段，所述調(diào)控片段可以包括與核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號、多腺苷酸化序列、復(fù)制起點(diǎn)、核酸限制性位點(diǎn)、和同源重組位點(diǎn)，例如啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，poly(a)信號等。
15、本專利技術(shù)提供了重組載體，其包括：
16、載體骨架和本專利技術(shù)所述的核酸；
17、或載體骨架和本專利技術(shù)所述的表達(dá)模塊。
18、進(jìn)一步的，本專利技術(shù)所述的載體骨架來源包括原核載體。更進(jìn)一步的，所述的原核載體包括可用于大腸桿菌目的蛋白表達(dá)的原核載體，本專利技術(shù)對此不做限定。
19、更進(jìn)一步的，本專利技術(shù)所述的重組載體中的載體骨架為pet28a。
20、在一些具體的實(shí)施例中，本專利技術(shù)所述的核酸包括如下所示中的至少一個(gè)：
21、pet28a-egtb；
22、pet28a-egtc；
23、pet28a-egte；
24、pet28a-egtb-egte；
25、pet28a-egtb-egtc；
26、pet28a-egte-egtc；
27、pet28a-egtb-egte-egtc。
28、本專利技術(shù)所述重組載體，是指重組的核酸載體，是一種重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達(dá)所必不可少的合適的核酸序列或元件。對模式微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)必需的核酸序列或元件包括啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)及可能的其它序列。已知原核細(xì)胞利用啟動(dòng)子，增強(qiáng)子以及終止子。一經(jīng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入合適的宿主，載體可以獨(dú)立于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和發(fā)揮作用，或者，在一些情況下，自己整合進(jìn)入基因組。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”有時(shí)可以交換通用，因?yàn)橘|(zhì)粒是當(dāng)前最普遍使用的載體形式。然而，本專利技術(shù)意圖包括表達(dá)載體的這樣的其它形式，其發(fā)揮等價(jià)作用，其在本領(lǐng)域是已知的或?qū)⒆優(yōu)橐阎模ǖ幌抻冢嘿|(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒載體和/或僅為潛在的基因組插入物。
29、本專利技術(shù)提供了宿主，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染本專利技術(shù)所述的重組載體。
30、進(jìn)一步的，所述的宿主包括但不限于大腸桿菌、酵母、植物或動(dòng)物細(xì)胞，本專利技術(shù)對此不做限定。
31、更進(jìn)一步的，本專利技術(shù)以本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.亞砜合成酶變體，其具有如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列。
2.組合酶，其包括氨基水解酶、C-S裂解酶和/或權(quán)利要求1所述的亞砜合成酶變體；
3.核酸，其包括如下i)～iii)所示中的至少一種：
4.表達(dá)模塊，其特征在于，包括啟動(dòng)子、終止子和權(quán)利要求3所述的核酸。
5.重組載體，其特征在于，包括：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的載體骨架為pET28a。
7.宿主，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求5或6所述的重組載體。
8.權(quán)利要求7所述的宿主的制備方法，其特征在于，權(quán)利要求5或6所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主。
9.如下I)～VI)所示中的至少一種在麥角硫因制備中的應(yīng)用：
10.麥角硫因的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，步驟1中：
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的制備方法，其特征在于，步驟2中：
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述N，N，N
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟a中，
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟b中，
16.由權(quán)利要求10～15任一項(xiàng)所述的制備方法制得的產(chǎn)品。
...【技術(shù)特征摘要】
1.亞砜合成酶變體，其具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列。
2.組合酶，其包括氨基水解酶、c-s裂解酶和/或權(quán)利要求1所述的亞砜合成酶變體；
3.核酸，其包括如下i)～iii)所示中的至少一種：
4.表達(dá)模塊，其特征在于，包括啟動(dòng)子、終止子和權(quán)利要求3所述的核酸。
5.重組載體，其特征在于，包括：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述的載體骨架為pet28a。
7.宿主，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如權(quán)利要求5或6所述的重組載體。
8.權(quán)利要求7所述的宿主的制備方法，其特征在于，權(quán)利要求5或6所述的重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主。...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄧雯婷，秦國富，趙弘，于鐵妹，潘俊鋒，劉建，
申請(專利權(quán))人：深圳瑞德林生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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