【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及文庫制備，具體涉及一種巢式多重pcr高通量測序文庫制備方法及試劑盒。
技術介紹
1、隨著測序技術的發展，對基因組候選區段的重測序需求日益增加，人們對序列的關注超過了少數的snp，候選區段的范圍可能在5kb-10m之間。使用傳統sanger法或目標區域雜交捕獲測序價格昂貴，使用目標區域捕獲測序很好地解決了這一難題。目標區域捕獲技術可大致分為兩種：一種是基于雜交的捕獲測序技術，另一種是基于多重pcr的捕獲技術。兩者通過多重探針或者引物對感興趣的基因區域一次性捕獲，結合高通量測序技術，多樣本同時測序，得到目標區域的序列信息。相對于全基因組測序，目標捕獲測序技術在大樣本量篩查的同時極大地降低成本。但前者的實驗流程繁瑣，探針成本較高，限制了其在臨床上的應用，后者實驗操作簡單，靈活性強，適用于孟德爾遺傳性疾病的篩查和診斷、gwas候選區段重測序、qtl定位區段重測序、精準醫療研究與應用等領域。
2、高通量snp檢測服務結合多重pcr和高通量測序技術，對需要檢測的位點設計特異性引物，在單管內進行多重pcr擴增，不同的樣本以不同的標簽(barcode)引物區分。混合樣本后，在測序平臺上，對擴增子進行測序，測序結果使用生物信息學方法，區分不同樣本，最終獲得每個位點的snp信息。這種方法適用于不同目的遺傳學研究，例如疾病基因組研究、腫瘤基因組研究、疾病與基因的關聯研究、臨床分子診斷等，在植物基因組研究中，可用于qtl定位及分子育種，非常適合大規模樣本的snp分析。
3、雖然多重pcr實驗操作簡單、單個檢測成本很
4、在多重擴增中隨著引物對數的增加，引物二聚體的形成不可避免，很多公司通過額外的酶處理對過多的引物二聚體進行消除，如ampliseq公司，先采用一步特異性擴增，然后通過酶消化掉引物二聚體和擴增子中的特異性引物序列，最后對產物進行文庫制備，整個過程繁瑣。后來paragon公司改良了這個方法，專利技術了clean?plex二聚體消除技術，采用特定的酶只消除多重pcr過程中的引物二聚體，然后采用通用引物對消化后的產物進行通用擴增，但是對于引物的非特異性擴增沒有更好的解決方法。
5、概而言之，現有技術的缺陷體現在：(1)現有方法本身無法減少引物二聚體的形成，其方法是在引物二聚體產生之后采用酶消化的方式進行，采用事后去除引物二聚體的方式，其多重pcr過程中產生的引物二聚體會極大地影響pcr擴增的效率和均一性；(2)現有方法需額外采用一步消化步驟，操作比較繁瑣；(3)采用常規的兩條引物擴增，對于一些特異性不好的區域很難設計特異的引物；(4)現有方法對于連續區域擴增需要在多個pcr管中分別進行。
技術實現思路
1、本申請提供一種巢式多重pcr高通量測序文庫制備方法及試劑盒，有效避免多重pcr擴增過程中產生的二聚體，并且采用巢式擴增方法大大增加引物的特異性，提高數據的利用率，還能有效抑制重疊擴增子引物之間的互相擴增。
2、根據第一方面，一種實施例中提供一種巢式多重pcr高通量測序文庫制備方法，該方法包括：
3、第一輪pcr擴增：使用正向引物和反向引物對目標區域進行擴增，其中上述正向引物是與上述目標區域結合的正向特異性序列，上述反向引物包括3’端的與上述目標區域結合的反向特異性序列和5’端的第一通用測序序列；
4、擴增產物的純化：對上述第一輪pcr擴增的產物進行純化；
5、第二輪pcr擴增：使用巢式引物、第一標簽引物和第二通用引物對純化后的產物進行擴增，其中上述巢式引物位于上述正向引物的下游，上述巢式引物包括5’端的第二通用測序序列和3’端的特異性序列，上述第一標簽引物3’端序列和上述反向引物5’端的第一通用測序序列部分或全部序列相同，且上述第一標簽引物還包括第一標簽序列，上述第二通用引物3’端序列和上述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
6、在優選實施例中，上述第二通用引物是第二標簽引物，該第二標簽引物3’端序列和上述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同，且上述第二標簽引物還包括第二標簽序列。
7、根據第二方面，另一種實施例中提供一種巢式多重pcr高通量測序文庫制備方法，該方法包括：
8、第一輪pcr擴增：使用正向引物、反向引物和第一標簽引物對目標區域進行擴增，其中上述正向引物是與上述目標區域結合的正向特異性序列，上述反向引物包括3’端的與上述目標區域結合的反向特異性序列和5’端的第一通用測序序列，上述第一標簽引物3’端序列和上述反向引物5’端的第一通用測序序列部分或全部序列相同，且上述第一標簽引物還包括第一標簽序列；
9、擴增產物的純化：對上述第一輪pcr擴增的產物進行純化；
10、第二輪pcr擴增：使用巢式引物、第一通用引物和第二通用引物對純化后的產物進行擴增，其中上述巢式引物位于上述正向引物的下游，上述巢式引物包括5’端的第二通用測序序列和3’端的特異性序列，上述第一通用引物3’端序列和上述第一標簽引物5’端部分或全部序列相同，上述第二通用引物3’端序列和上述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
11、在優選實施例中，上述第二通用引物是第二標簽引物，該第二標簽引物3’端序列和上述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同，且上述第二標簽引物還包括第二標簽序列。
12、在優選實施例中，上述反向引物上還包括分子標簽序列。
13、在優選實施例中，上述分子標簽序列是8-24bp的隨機序列。
14、在優選實施例中，上述方法對多個連續的目標區域進行擴增，每個目標區域都有對應的正向引物、反向引物和巢式引物，并且相鄰擴增子區域之間形成擴增重疊。
15、在優選實施例中，上述正向引物、反向引物和巢式引物均是由多條分別靶向不同的目標區域的引物組成的引物池。
16、在優選實施例中，每個目標區域的正向引物和相鄰區域的正向引物、巢式引物和相鄰區域的巢式引物、反向引物和相鄰區域的反向引物擴增方向相反。
17、在優選實施例中，上述第一輪pcr擴增和/或第二輪pcr擴增的循環數均是2-30個循環。
18、在優選實施例中，上述第一標簽序列和/或第二標簽序列的長度均是8-15bp。
19、根據第三方面，一種實施例中提供一種巢式多重pcr高通量測序文庫制備試劑盒，該試劑盒包括：...
【技術保護點】
1.一種檢測低頻突變的巢式多重PCR擴增方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反向引物中包含的標簽序列為分子標簽或樣本標簽。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二輪PCR擴增中進一步包括使用第二通用引物。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在第二輪PCR擴增之后，進一步包括測序步驟：將第二輪PCR擴增產物進行核酸序列測定，獲得測序數據。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，通過對測序數據的比對分析，獲得樣本低頻突變信息。
7.一種多樣本目標區域的巢式多重PCR擴增方法，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一標簽序列用于區分待測核酸的樣本來源。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，第二輪PCR擴增進一步包括使用第二通用引物，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端
10.根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，在進行第二輪PCR擴增之前，將第一輪PCR擴增產物混合。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一輪PCR擴增產物攜帶第一標簽序列。
12.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在第二輪PCR擴增之后，進一步包括測序步驟：將第二輪PCR擴增產物進行核酸序列測定，獲得測序數據。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，通過對測序數據的比對分析，獲得多樣本目標區域核酸序列信息。
14.一種檢測低頻突變的巢式多重PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
15.根據權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述反向引物中包含的標簽序列為分子標簽或樣本標簽。
16.根據權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述第二組擴增引物進一步包括第二通用引物。
17.根據權利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
18.根據權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括對第二輪PCR擴增產物進行核酸序列測定的試劑。
19.一種多樣本目標區域的巢式多重PCR擴增試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：
20.根據權利要求19所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標簽序列用于區分待測核酸的樣本來源。
21.根據權利要求19所述的試劑盒，其特征在于，第二組擴增引物進一步包括第二通用引物，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
22.根據權利要求19所述的試劑盒，其特征在于，所述第一輪PCR擴增產物攜帶第一標簽序列。
23.根據權利要求19所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括對第二輪PCR擴增產物進行核酸序列測定的試劑。
...【技術特征摘要】
1.一種檢測低頻突變的巢式多重pcr擴增方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反向引物中包含的標簽序列為分子標簽或樣本標簽。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二輪pcr擴增中進一步包括使用第二通用引物。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在第二輪pcr擴增之后，進一步包括測序步驟：將第二輪pcr擴增產物進行核酸序列測定，獲得測序數據。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，通過對測序數據的比對分析，獲得樣本低頻突變信息。
7.一種多樣本目標區域的巢式多重pcr擴增方法，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一標簽序列用于區分待測核酸的樣本來源。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，第二輪pcr擴增進一步包括使用第二通用引物，所述第二通用引物3’端序列和所述巢式引物5’端的第二通用測序序列部分或者全部序列相同。
10.根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，在進行第二輪pcr擴增之前，將第一輪pcr擴增產物混合。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一輪pcr擴增產物攜帶第一標簽序列。
12.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，在第二輪pcr擴增之后，進一步包括測序步驟：將第...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊林，張艷艷，陳芳，蔣慧，
申請(專利權)人：深圳華大智造科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。