【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微流控細胞分選領域，具體涉及一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法。
技術介紹
1、small?rna(小rna)作為一種生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。近年來，研究發現不僅在細胞內，還在細胞膜上發現了相應的小rna，它們在細胞間交流、免疫調解、穩態等方面也具有重要的功能。
2、使用下一代測序技術的小rna測序(srna-seq)是已知或未知小rna序型分析和發現的重要研究手段。但針對群體細胞的srna-seq只能獲得平均信息，細胞間具有異質性，無法研究不同細胞間細胞膜小rna表型的差異。細胞膜小rna的產生通常受到胞內基因的調控，無法揭示細胞轉錄組在細胞膜小rna形成過程中的作用。因此將具有不同表型細胞膜小rna的細胞分選為不同的亞群在進一步研究小rna的過程中是必要的。
3、目前，依據目標物的表型進行細胞分選的微流控技術比較成熟，其中最常用的是熒光激活細胞分選技術，該方法通常是對細胞上的目標物進行熒光標記，在細胞流動過程中，不同熒光強度的細胞會受到不同的電場力，從而依據熒光強度的差異分選出目標物表型不同的細胞亞群。但是該技術存在以下問題：1)只能分選熒光強度大的細胞，當目標物的表型較低時，細胞受到的電場力小，無法對該類細胞實現高效分選；當不同細胞間的目標物表型差異較小時，細胞所表現的熒光強度差異較小，難以將其分為不同的亞群。另外，熒光激活細胞分選技術只能分選2-4個細胞亞群。2)在分選時，細胞會受到高電壓和高流速帶
技術實現思路
1、為了克服上述現有技術的缺點，本專利技術的目的在于提供一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，用以解決現有微流控芯片結合外加磁場技術不適用于細胞膜小rna的分選的問題。
2、本專利技術具體通過以下技術方案實現：
3、本專利技術的第一個方面，公開了一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，用探針2識別細胞膜小rna，然后將特異性識別的細胞膜小rna與帶有探針1的鏈霉親和素磁珠雜交，再將完成雜交的細胞流入微流控芯片，實現不同區域對不同細胞表型亞群的分選；
4、其中，所述探針1的5’端結合有生物素，3’端結合有熒光染料；所述探針2由5’端50個堿基的細胞膜小rna識別區、10個堿基的間隔區和3’端22個堿基用于雜交探針1區組成；所述微流控芯片的微流體通道寬度呈梯度變化。
5、優選地，探針1的序列如seq?id?no.1所示。
6、優選地，探針2的序列如seq?id?no.2所示。
7、優選地，所述熒光染料為cy5或alex488。
8、優選地，所述微流控芯片捕獲柱的高度為50μm。
9、優選地，所述微流控芯片通過軟光刻技術制備得到。
10、優選地，還包括探針3，所述探針3的5’端22個堿基雜交識別探針2，3’端20個堿基雜交探針1。
11、進一步優選地，探針3的序列如seq?id?no.3所示。
12、優選地，探針2和探針3的終濃度比為1:1。
13、進一步優選地，探針2和探針3的終濃度均為1.5μm。
14、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
15、本專利技術提供的一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，探針1的5’端結合有生物素，能夠快速且穩定地結合鏈霉親和素，3’端結合有熒光染料，能夠通過熒光強度得知磁珠數量。探針2的5’端的細胞膜小rna識別區域能夠特異性識別細胞膜小rna，10個堿基的間隔區能夠減少空間位阻，3’端用于雜交探針1的區域夠雜交細胞膜表面不同的小rna。微流控芯片的微流體通道寬度呈梯度變化，通過通道寬度的不斷增加，能夠保證分選過程中不同區域有不同的流速，進而使細胞受到不同的作用力，從而滿足捕獲和分選細胞的要求。該方法利用探針2使細胞膜小rna被識別，利用帶磁珠的探針1與被特異性識別的細胞膜小rna雜交，特異性磁標記細胞膜小rna，將其表型轉化為對應的磁場強度，在外加磁場的條件下結合流速線性變化的微流控芯片，實現對不同表型細胞膜小rna細胞亞群的分選，操作簡便，分選效果好，為揭示不同表型細胞膜小rna的產生和相應的調控機制提供了新方法。相較于目前常用的熒光激活分選技術，本方法巧妙運用微流控磁分選技術，通過對細胞膜小rna特異性磁標記，結合流速線性變化的微流控芯片，能夠平衡細胞受到的磁場力和流體作用的力，實現在通道窄流速快的區域捕獲表型高的細胞，在通道寬流速慢的區域捕獲表型低的細胞。通過設計的核酸探針之間的雜交，對細胞膜小rna進行磁珠標記，即在磁場的作用下能夠受到磁場力而被捕獲。該方法能夠分選表型差異較小的細胞亞群，也不會對細胞產生不可逆的損傷。
16、進一步地，捕獲柱的高度為50μm，能夠滿足對細胞群體的捕獲，足夠容納近百個細胞。
17、進一步地，探針3的5’端能與探針2雜交，3’端能與磁珠雜交，從而用于雜交識別探針和磁珠修飾探針，適用不同細胞的分選。
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1.一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，用探針2識別細胞膜小RNA，然后將特異性識別的細胞膜小RNA與帶有探針1的鏈霉親和素磁珠雜交，再將完成雜交的細胞流入微流控芯片，實現不同區域對不同細胞表型亞群的分選；
2.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針1的序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針2的序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，所述熒光染料為Cy5或Alex488。
5.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，所述微流控芯片捕獲柱的高度為50μm。
6.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，所述微流控芯片通過軟光刻技術制備得到。
7.根據權利要求1～6任意一項所述的一種基于細胞膜小RNA表型
8.根據權利要求7所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針3的序列如SEQ?ID?NO.3所示。
9.根據權利要求7所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針2和探針3的終濃度比為1:1。
10.根據權利要求9所述的一種基于細胞膜小RNA表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針2和探針3的終濃度均為1.5μM。
...【技術特征摘要】
1.一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，用探針2識別細胞膜小rna，然后將特異性識別的細胞膜小rna與帶有探針1的鏈霉親和素磁珠雜交，再將完成雜交的細胞流入微流控芯片，實現不同區域對不同細胞表型亞群的分選；
2.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針1的序列如seq?id?no.1所示。
3.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，探針2的序列如seq?id?no.2所示。
4.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，所述熒光染料為cy5或alex488。
5.根據權利要求1所述的一種基于細胞膜小rna表型的微流控細胞分選方法，其特征在于，所述微流控芯片捕獲...
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