【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種rna在的設(shè)計及制備方法，更具體一點說，涉及一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
1、環(huán)狀rna是一種不暴露末端堿基且完全閉環(huán)的rna分子與線性rna相比，環(huán)狀rna分子具有更高的穩(wěn)定性和細胞內(nèi)半衰期，無論在rna疫苗領(lǐng)域和rnai藥物領(lǐng)域都具有巨大的應(yīng)用潛力。目前環(huán)狀rna多以體外方式合成，存在大規(guī)模生產(chǎn)純化成本高，操作繁瑣，且較易引發(fā)免疫原性等諸多問題從而限制了環(huán)狀rna的大規(guī)模應(yīng)用，因此體內(nèi)合成環(huán)狀rna的策略得到了廣泛關(guān)注。
2、目前，體內(nèi)合成環(huán)狀rna方法是將核酶作為環(huán)化元件，以細胞和大腸桿菌為載體，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式大量表達目的環(huán)狀rna，該方法僅需簡單的rna提取及純化步驟即可實現(xiàn)環(huán)狀rna富集。與體外合成相比，體內(nèi)合成環(huán)狀rna具有操作簡便、生產(chǎn)純化成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。目前常用的體內(nèi)合成方法一般是使用i型內(nèi)含子或alu序列作為環(huán)化元件，這些元件只能對特定環(huán)狀rna進行環(huán)化，無法實現(xiàn)對任意環(huán)狀rna序列的環(huán)化，同時還會引入一小段非預(yù)期序列，導(dǎo)致最終制備的環(huán)狀rna上總是會有一段額外序列。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供具有能夠?qū)崿F(xiàn)合成序列精確的環(huán)狀rna等技術(shù)特點的一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法。
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
3、本專利技術(shù)一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的
4、一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法，該方法包括如下步驟：
5、步驟1)：將目的片段c1700、c1400、c500、c64分別連接至ii型內(nèi)含子(chen?etal.,biorvix,2022，發(fā)表的ii型內(nèi)含子序列)d1和d6之間，得到4種環(huán)狀rna的編碼dna序列；
6、步驟2)：將上述序列上游分別插入t7啟動子序列taatacgactcactatagg，得到融合了t7啟動子的4種環(huán)狀rna的編碼dna分子，其分別為mcs-1700、mcs-1400、mcs-500、mcs-64；
7、步驟3)：將上述四種編碼dna分子分別插入到pet28a載體的xhoi及bglii位點之間，得到的重組質(zhì)粒，其分別為pet28-1700、pet28-1400、pet28-500和pet28-64；
8、步驟4)：將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞ht115(de3)中，篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)，利用酚/氯仿進行裂解抽提，得到目的rna粗提物，其分別為crna-1700、crna-1400、crna-500、crna-dumbbell。
9、優(yōu)選的，將目的rna粗提物經(jīng)licl純化后，能夠通過rnase?r、rt-pcr、熒光表達檢測實現(xiàn)檢測目的rna是否環(huán)化。
10、優(yōu)選的，步驟4)具體為：將四種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌ht115(de3)，并將轉(zhuǎn)入了pet-28a原始質(zhì)粒的菌作為對照組，在含0.1mg/ml硫酸卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基中37℃，220rpm培養(yǎng)菌落至od600為0.6，加入0.1mg/ml終濃度的iptg，37℃,220rpm誘導(dǎo)4h；在8000rpm條件下1min離心收集菌體，棄上清，用1/10體積的depc水緩慢重懸菌體，加入與depc水等體積的rna提取酚，在64℃水浴5min，在冰上完全冷卻后，加入與depc水等體積的氯仿，劇烈震蕩1min，在12000rpm條件下15min離心，取上清，加入1/2體積氯仿，劇烈震蕩1min，在12000rpm條件下10min離心，取上清，得到目的rna。
11、優(yōu)選的，mcs-1700序列如下：
12、taatacgactcactataggctattatcgagcgaacgccttatgcgatgaaagtcgcacgtagggtgtagaccaagcgaaatcctatgcatttaggatagtgaggtatgggggaaacccaaacatgggacgctctaatacagacatggtgcgaagagtctattgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactgcggagcacacaccctcaagccagagggcagtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttcattttattcctatactggctgcttatggtgacaattgagagatcgttaccatatagctattggattggccatccggtgactaatagagctattatatatccctttgttgggtttataccacttagcttgaaagaggttaaaacattacaattcattgttaagttgaatacagcaaaactagtgccaccatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaaatccatgcccgattcagaagacgcgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgc本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于，所述環(huán)狀RNA包括四種目的片段：c1700、c1400、c500、c64，其中，c1700的片段為隨機序列；c1400的片段被設(shè)計用于熒光檢測，首先將IRES序列分為兩段，反向拼接于GFP序列兩端，生成一個ES-GFP-IR的序列；c500的片段是從IRES序列中選取；c64的環(huán)狀序列是由一個23bp的雙鏈和兩端各9bp的莖環(huán)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于該方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：將目的RNA粗提物經(jīng)LiCl純化后，能夠通過RNase?R、RT-PCR、熒光表達檢測實現(xiàn)檢測目的RNA是否環(huán)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：步驟4)具體為：將四種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌HT115(DE3)，并將轉(zhuǎn)入了pET-28a原始質(zhì)粒的菌作為對照組，在含0.1mg/ml硫酸卡
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：MCS-1700序列如下：
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：MCS-1400序列如下：
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：MCS-500序列如下：
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種環(huán)狀RNA在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：MCS-64序列如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于，所述環(huán)狀rna包括四種目的片段：c1700、c1400、c500、c64，其中，c1700的片段為隨機序列；c1400的片段被設(shè)計用于熒光檢測，首先將ires序列分為兩段，反向拼接于gfp序列兩端，生成一個es-gfp-ir的序列；c500的片段是從ires序列中選取；c64的環(huán)狀序列是由一個23bp的雙鏈和兩端各9bp的莖環(huán)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于該方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：將目的rna粗提物經(jīng)licl純化后，能夠通過rnase?r、rt-pcr、熒光表達檢測實現(xiàn)檢測目的rna是否環(huán)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種環(huán)狀rna在大腸桿菌體內(nèi)精確合成的設(shè)計及制備方法,其特征在于：步驟4)具體為：將四種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌ht115(de3)，并將轉(zhuǎn)入了pet-28a原始質(zhì)粒的菌作為對照組，在含0.1mg/ml硫酸卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙夏陽，呂崇潤，金偉波，
申請(專利權(quán))人：浙江理工大學(xué)紹興生物醫(yī)藥研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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