本公開內容提供了經改造T細胞受體(TCR)、包含TCR的細胞以及制備和使用TCR的方法。本公開內容涉及特異性識別來自腫瘤抗原NDC80CT的表位的TCR。因此，本公開內容的一些方面涉及經改造T細胞受體(TCR)、編碼TCR的核酸、以及包含核酸和TCR的細胞。還提供了包含本公開內容的細胞、核酸或經改造TCR的組合物，制備細胞的方法，以及使用本公開內容的一些實施方案用于治療性處理的方法。
1、過繼性t細胞治療是一種用于癌癥的潛在強效治療，其通過對天然t細胞進行遺傳修飾以使它們具有腫瘤特異性并提高它們破壞腫瘤細胞的能力。經遺傳修飾的t細胞能夠表達嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor，car)或t細胞受體(t-cell?receptor，tcr)，這在多項臨床試驗中顯示出令人印象深刻的結果。tcr經改造t(tcr-t)細胞已顯示出針對腫瘤的巨大前景。tcr的效力取決于其與肽-主要組織相容性復合體(peptide-majorhistocompatibility?complex，pmhc)的相互作用，所述復合體通過肽與mhc結合而形成。胞內抗原被切割成肽鏈并由mhc分子呈現以形成pmhc。待由i類mhc蛋白表達的胞質蛋白(其中大多數為缺陷型核糖體翻譯產物)通過蛋白水解被切割成肽鏈。然后，這些肽與i類mhc蛋白結合，所述i類mhc蛋白在所有有核細胞的細胞表面上表達。一些稱為抗原呈遞細胞(antigen-presenting?cell，apc)的細胞表達ii類mhc蛋白。它們通過內吞作用將外來物質蛋白內化，并將所述外來物質蛋白切割成肽鏈，以與來自t細胞的ii類mhc蛋白t細胞受體結合，其必須與患者的人白細胞抗原(human?leukocyte?antigen，hla)等位基因匹配，識別這些pmhc并導致癌細胞殺傷。(人i類mhc蛋白從3個基因區域表達：hla-a、hla-b和hla-c，并且人ii類mhc蛋白也從3個基因區域表達：hla-dr、hla-dp和hla-dq。)需要針對癌癥特異性抗原并可用于治療癌癥的tcr的改造。
1、本公開內容提供了組合物和方法，其包括肽、經改造t細胞受體(tcr)、包含肽和tcr的細胞、以及制備和使用肽和tcr的方法。本公開內容涉及tcr，其特異性識別ndc80?ct抗原，例如具有glneeiarv(seq?id?no：15)的氨基酸序列的肽。
2、因此，本公開內容涉及包含抗原結合可變區的多肽，所述抗原結合可變區包含含有與avqagssaskii(seq?id?no：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。還描述了包含抗原結合可變區的多肽，所述抗原結合可變區包含含有與asslsggiyeqy(seq?idno：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。
3、本公開內容還提供了t細胞受體(tcr)和經改造tcr，例如包含tcr-a多肽和tcr-b多肽的tcr，其中tcr-a多肽包含含有與avqagssaskii(seq?id?no：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3，并且tcr-b多肽包含含有與asslsggiyeqy(seq?id?no：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。tcr-a多肽可包含含有與avqagssaskii(seq?idno：8)具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推導出的任何范圍)序列同一性的氨基酸序列的cdr3，并且tcr-b多肽可包含含有與asslsggiyeqy(seq?id?no：14)具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推導出的任何范圍)序列同一性的氨基酸序列的cdr3。tcr-a多肽可包含含有avqagssaskii(seq?id?no：8)的氨基酸序列的cdr3，并且tcr-b多肽可包含含有asslsggiyeqy(seq?id?no：14)的氨基酸序列的cdr3。
4、還描述了包含本公開內容的tcr和cd3結合區的融合蛋白。cd3結合區可包含cd3特異性抗原結合片段(fragment?antigen?binding，fab)、單鏈可變片段(single?chainvariable?fragment，scfv)、單結構域抗體或單鏈抗體。示例性cd3特異性抗原結合片段(fab)是本領域已知的。例如，通過引用并入本文的us20180222981公開了與cd3特異性結合的可變區，其可用于本公開內容的一些方面。抗cd3抗體和可變區公開于us20180117152中，其也通過引用并入。
5、本公開內容還涉及相對于seq?id?no：15的肽包含至少66％序列同一性的肽。還公開了包含本公開內容的肽的多肽。肽或多肽可與seq?id?no：15具有或具有至少60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100％(或其中可推導出的任何范圍)序列同一性。
6、本公開內容還涉及包含本公開內容的肽或多肽以及mhc多肽的分子復合物。本公開內容還涉及產生肽特異性免疫效應細胞的方法，其包括：(a)獲得起始免疫效應細胞群；和(b)使起始免疫效應細胞群與本公開內容的肽接觸，從而產生肽特異性免疫效應細胞。本公開內容還描述了根據本公開內容的方法產生的肽特異性經改造t細胞和tcr。另一些方面涉及體外分離的樹突細胞，其包含本公開內容的肽、多肽、核酸或表達載體。
7、還提供了用于對患者進行預后或用于在患者中檢測t細胞應答的方法，所述方法包括：使來自患者的生物樣品與本公開內容的組合物、肽或多肽接觸。又一些方面涉及肽特異性結合分子，其與本公開內容的肽結合或與肽-mhc復合物結合。示例性結合分子包括抗體、tcr模擬抗體、scfv、納米抗體、適配體和darpin。相關方法提供了這樣的方法，其包括使包含至少一種mhc多肽以及本公開內容的肽或多肽的組合物與包含t細胞的組合物接觸，并通過對檢測標簽進行檢測來檢測具有結合的肽和/或mhc多肽的t細胞。
8、另一些方面涉及包含本公開內容的肽、多肽、核酸、表達載體或組合物的藥盒。另一些方法方面涉及克隆t細胞受體(tcr)的方法，所述方法包括(a)獲得起始免疫效應細胞群；(b)使起始免疫效應細胞群與本公開內容的肽接觸，從而產生肽特異性免疫效應細胞；(c)純化對肽具有特異性的免疫效應細胞，以及(d)從所純化的免疫效應細胞中分離tcr序列。另一些方面涉及制備細胞的方法，其包括將本公開內容的核酸或表達載體轉移到細胞中。另一些方面涉及用于制備治療性t細胞疫苗的體外方法，其包括將t細胞與本公開內容的肽共培養。
6.權利要求4或5所述的多肽，其中所述可變區包含含有VSGLRG(SEQ?ID?NO：6)的氨基酸序列的CDR1和/或含有LYSAGEE(SEQ?ID?NO：7)的氨基酸序列的CDR2。
>8.權利要求7所述的多肽，其中所述可變區包含SEQ?ID?NO：4的氨基酸序列。9.權利要求1至8中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含T細胞受體α(TCR-a)可變區。
10.權利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含TCR-a可變區和恒定區。
11.權利要求1至10中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含信號肽。
12.權利要求11所述的多肽，其中所述信號肽包含與SEQ?ID?NO：5具有至少80％同一性的氨基酸序列。
13.權利要求12所述的多肽，其中所述信號肽包含SEQ?ID?NO：5的氨基酸序列。
14.多肽，其包含抗原結合可變區，所述抗原結合可變區包含含有與ASSLSGGIYEQY(SEQID?NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。
15.權利要求14所述的多肽，其中所述CDR3包含ASSLSGGIYEQY(SEQ?ID?NO：14)的氨基酸序列。
16.權利要求14或15所述的多肽，其中所述可變區包含CDR1、CDR2和/或CDR3。
17.權利要求16所述的多肽，其中所述可變區包含與SGHDT(SEQ?ID?NO：12)具有至少80％序列同一性的CDR1。
18.權利要求16或17所述的多肽，其中所述可變區包含與YYEEEE(SEQ?ID?NO：13)具有至少80％序列同一性的CDR2。
19.權利要求17或18所述的多肽，其中所述可變區包含含有SGHDT(SEQ?ID?NO：12)的氨基酸序列的CDR1和/或含有YYEEEE(SEQ?ID?NO：13)的氨基酸序列的CDR2。
20.權利要求14至19中任一項所述的多肽，其中所述可變區包含與SEQ?ID?NO：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
21.權利要求20所述的多肽，其中所述可變區包含SEQ?ID?NO：10的氨基酸序列。
22.權利要求14至21中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含T細胞受體β(TCR-b)可變區。
23.權利要求22所述的多肽，其中所述多肽包含TCR-b可變區和恒定區。
24.權利要求14至23中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含信號肽。
25.權利要求24所述的多肽，其中所述信號肽包含與SEQ?ID?NO：11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
26.權利要求25所述的多肽，其中所述信號肽包含SEQ?ID?NO：11的氨基酸序列。
27.經改造T細胞受體(TCR)，其包含TCR-a多肽和TCR-b多肽，其中所述TCR-a多肽包含含有與AVQAGSSASKII(SEQ?ID?NO：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，并且所述TCR-b多肽包含含有與ASSLSGGIYEQY(SEQ?ID?NO：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的CDR3。
28.權利要求27所述的TCR，其中所述TCR-a多肽包含含有SEQ?ID?NO：8的氨基酸序列的CDR3，并且所述TCR-b多肽包含含有SEQ?ID?NO：14的氨基酸序列的CDR3。
29.權利要求27或28所述的TCR，其中所述TCR包含：TCR-a多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可變區；以及TCR-b多肽，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3的可變區。
30.權利要求29所述的TCR...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.多肽，其包含抗原結合可變區，所述抗原結合可變區包含含有與avqagssaskii(seqid?no：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。
2.權利要求1所述的多肽，其中所述cdr3包含avqagssaskii(seq?id?no：8)的氨基酸序列。
3.權利要求1或2所述的多肽，其中所述可變區包含cdr1、cdr2和/或cdr3。
4.權利要求3所述的多肽，其中所述可變區包含與vsglrg(seq?id?no：6)具有至少80％序列同一性的cdr1。
5.權利要求3或4所述的多肽，其中所述可變區包含與lysagee(seq?id?no：7)具有至少80％序列同一性的cdr2。
6.權利要求4或5所述的多肽，其中所述可變區包含含有vsglrg(seq?id?no：6)的氨基酸序列的cdr1和/或含有lysagee(seq?id?no：7)的氨基酸序列的cdr2。
7.權利要求1至6中任一項所述的多肽，其中所述可變區包含與seq?id?no：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
8.權利要求7所述的多肽，其中所述可變區包含seq?id?no：4的氨基酸序列。
9.權利要求1至8中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含t細胞受體α(tcr-a)可變區。
10.權利要求9所述的多肽，其中所述多肽包含tcr-a可變區和恒定區。
11.權利要求1至10中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含信號肽。
12.權利要求11所述的多肽，其中所述信號肽包含與seq?id?no：5具有至少80％同一性的氨基酸序列。
13.權利要求12所述的多肽，其中所述信號肽包含seq?id?no：5的氨基酸序列。
14.多肽，其包含抗原結合可變區，所述抗原結合可變區包含含有與asslsggiyeqy(seqid?no：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。
15.權利要求14所述的多肽，其中所述cdr3包含asslsggiyeqy(seq?id?no：14)的氨基酸序列。
16.權利要求14或15所述的多肽，其中所述可變區包含cdr1、cdr2和/或cdr3。
17.權利要求16所述的多肽，其中所述可變區包含與sghdt(seq?id?no：12)具有至少80％序列同一性的cdr1。
18.權利要求16或17所述的多肽，其中所述可變區包含與yyeeee(seq?id?no：13)具有至少80％序列同一性的cdr2。
19.權利要求17或18所述的多肽，其中所述可變區包含含有sghdt(seq?id?no：12)的氨基酸序列的cdr1和/或含有yyeeee(seq?id?no：13)的氨基酸序列的cdr2。
20.權利要求14至19中任一項所述的多肽，其中所述可變區包含與seq?id?no：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
21.權利要求20所述的多肽，其中所述可變區包含seq?id?no：10的氨基酸序列。
22.權利要求14至21中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含t細胞受體β(tcr-b)可變區。
23.權利要求22所述的多肽，其中所述多肽包含tcr-b可變區和恒定區。
24.權利要求14至23中任一項所述的多肽，其中所述多肽還包含信號肽。
25.權利要求24所述的多肽，其中所述信號肽包含與seq?id?no：11具有至少80％同一性的氨基酸序列。
26.權利要求25所述的多肽，其中所述信號肽包含seq?id?no：11的氨基酸序列。
27.經改造t細胞受體(tcr)，其包含tcr-a多肽和tcr-b多肽，其中所述tcr-a多肽包含含有與avqagssaskii(seq?id?no：8)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3，并且所述tcr-b多肽包含含有與asslsggiyeqy(seq?id?no：14)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的cdr3。
28.權利要求27所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含含有seq?id?no：8的氨基酸序列的cdr3，并且所述tcr-b多肽包含含有seq?id?no：14的氨基酸序列的cdr3。
29.權利要求27或28所述的tcr，其中所述tcr包含：tcr-a多肽，其包含含有cdr1、cdr2和cdr3的可變區；以及tcr-b多肽，其包含含有cdr1、cdr2和cdr3的可變區。
30.權利要求29所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含與seq?id?no：6具有至少80％序列同一性的cdr1，和/或所述tcr-b多肽包含與seq?id?no：12具有至少80％序列同一性的cdr1。
31.權利要求30所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含含有seq?id?no：6的氨基酸序列的cdr1，并且所述tcr-b多肽包含含有seq?id?no：12的氨基酸序列的cdr1。
32.權利要求29至31中任一項所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含與seq?id?no：7具有至少80％序列同一性的cdr2，并且所述tcr-b多肽包含與seq?id?no：13具有至少80％序列同一性的cdr2。
33.權利要求32所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含含有seq?id?no：7的氨基酸序列的cdr2，并且所述tcr-b多肽包含含有seq?id?no：13的氨基酸序列的cdr2。
34.權利要求29至33中任一項所述的tcr，其中所述tcr-a多肽的cdr1、cdr2和cdr3分別包含seq?id?no：6、7和8的氨基酸序列，并且其中所述tcr-b多肽的cdr1、cdr3和cdr3分別包含seq?id?no：12、13和14的氨基酸序列。
35.權利要求29至34中任一項所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含與seq?id?no：4具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，并且所述tcr-b多肽包含與seq?id?no：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
36.權利要求35所述的tcr，其中所述tcr-a多肽包含seq?id?no：4的氨基酸序列，并且所述tcr-b多肽包含與seq?id?no：10具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
37.權利要求27至36中任一項所述的tcr，其中所述tcr包含修飾或者是嵌合的。
38.權利要求27至37中任一項所述的tcr，其中所述tcr-a多肽和tcr-b多肽可操作地連接。
39.權利要求38所述的tcr，其中所述tcr-a多肽和tcr-b多肽通過肽鍵可操作地連接。
40.權利要求38所述的tcr，其中所述tcr是單鏈tcr。
41.權利要求39或41所述的tcr，其中所述tcr-a多肽和tcr-b多肽位于同一多肽上，并且其中所述tcr-b在所述tcr-a的氨基近端。
42.權利要求39或41所述的tcr，其中所述tcr-a多肽和tcr-b多肽位于同一多肽上，并且其中所述tcr-a在所述tcr-b的氨基近端。
43.權利要求39至42中任一項所述的tcr，其中所述tcr包含在所述tcr-a與tcr-b多肽之間的接頭。
44.權利要求39至43中任一項所述的tcr，其中所述接頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基。
45.肽，其相對于seq?id?no:15包含至少66％序列同一性。
46.權利要求45所述的肽，其中所述肽包含seq?id?no:15。
47.權利要求45所述的肽，其中所述肽包含seq?id?no:15的至少6個連續氨基酸。
48.權利要求45所述的肽，其中所述肽包含seq?id?no:15的至少7個連續氨基酸。
49.權利要求45所述的肽，其中所述肽包含seq?id?no:15的至少8個連續氨基酸。
50.權利要求45至49中任一項所述的肽，其中所述肽相對于seq?id?no:15包含至少77％序列同一性。
51.權利要求45至50中任一項所述的肽，其中所述肽相對于seq?id?no:15包含至少88％序列同一性。
52.權利要求45至51中任一項所述的肽，其中所述肽由7個氨基酸組成。
53.權利要求45至51中任一項所述的肽，其中所述肽由8個氨基酸組成。
54.權利要求45至51中任一項所述的肽，其中所述肽由9個氨基酸組成。
55.權利要求45所述的肽，其中所述肽由seq?id?no:15組成。
56.權利要求45至55中任一項所述的肽，其中所述肽是免疫原性的。
57.權利要求45至56中任一項所述的肽，其中所述肽是經修飾的。
58.權利要求57所述的肽，其中所述修飾包含與分子綴合。
59.權利要求57或58所述的肽，其中所述分子包含抗體、脂質、佐劑或檢測部分。
60.權利要求45至59中任一項所述的肽，其中所述肽相對于seq?id?no:15的肽具有1、2或3個替換。
61.多肽，其包含權利要求45至60中任一項所述的肽。
62.組合物，其包含至少一種mhc多肽以及權利要求45至61中任一項所述的肽或多肽。
63.權利要求62所述的組合物，其中所述mhc多肽與檢測標簽綴合和/或肽與檢測標簽綴合。
64.權利要求62或63所述的組合物，其中所述mhc多肽和肽有效連接。
65.權利要求64所述的組合物，其中所述mhc多肽和肽通過肽鍵有效連接。
66.權利要求64所述的組合物，其中所述mhc多肽和肽通過范德華力有效連接。
67.權利要求62至66中任一項所述的組合物，其中至少兩個mhc多肽與一個肽連接。
68.權利要求62至67中任一項所述的組合物，其中mhc多肽與肽的平均比率為4:1。
69.分子復合物，其包含權利要求45至61中任一項所述的肽或多肽以及mhc多肽。
70.肽特異性結合分子，其中所述分子與權利要求45至61中任一項所述的肽或多肽或者權利要求69所述的分子復合物特異性結合。
71.權利要求70所述的結合分子，其中所述結合分子是抗體、tcr模擬抗體、scfv、納米抗體、適配體或darpin。
72.產生肽特異性免疫效應細胞的方法，其包括：
73.權利要求72所述的方法，其中接觸進一步限定為將所述起始免疫效應細胞群與抗原呈遞細胞(apc)、人工抗原呈遞細胞(aapc)或人工抗原呈遞表面(aaps)共培養；其中所述apc、aapc或aaps在其表面上呈遞所述肽。
74.權利要求73所述的方法，其中所述apc是樹突細胞。
75.權利要求72至74中任一項所述的方法，其中所述免疫效應細胞是t細胞、外周血淋巴細胞、nk細胞、恒定nk細胞、nkt細胞。
76.權利要求72至75中任一項所述的方法，其中所述免疫效應細胞分化自間充質干細胞(msc)或誘導多能干(ips)細胞。
77.權利要求76所述的方法，其中所述t細胞是cd8+t細胞、cd4+t細胞或γδt細胞。
78.權利要求76所述的方法，其中所述t細胞是細胞毒性t淋巴細胞(ctl)。
79.權利要求72至78中任一項所述的方法，其中獲得包括從外周血單個核細胞(pbmc)中分離所述起始免疫效應細胞群。
80.權利要求72至79中任一項所述的方法，其中所述起始免疫效應細胞群獲自對象。
81.權利要求80所述的方法，其中所述對象是人。
82.權利要求80所述的方法，其中所述對象患有癌癥。
83.權利要求82所述的方法，其中所述癌癥包含ndc80?ct抗原陽性癌癥。
84.權利要求83所述的方法，其中所述癌癥包含對seq?id?no:15的肽呈陽性的癌細胞。
85.權利要求82至84中任一項所述的方法，其中所述對象已被確定為患有ndc80?ct抗原陽性癌癥。
86.權利要求85所述的方法，其中所述對象已被確定為具有對seq?id?no:15的肽呈陽性的癌細胞。
87.權利要求82至86中任一項所述的方法，其中所述對象已被診斷出患有所述癌癥。
88.權利要求72至87中任一項所述的方法，其中所述方法還包括在所述共培養之前將所述肽或編碼所述肽的核酸引入到所述樹突細胞中。
89.權利要求88所述的方法，其中所述肽或編碼所述肽的核酸通過電穿孔引入。
90.權利要求88所述的方法，其中所述肽或編碼所述肽的核酸通過將所述肽或編碼所述肽的核酸添加至樹突細胞培養基來引入。
91.權利要求72至90中任一項所述的方法，其中所述免疫效應細胞與已引入所述肽或編碼所述肽的核酸的第二樹突細胞群共培養。
92.權利要求72至91中任一項所述的方法，其中在所述共培養之后，從所述免疫效應細胞純化cd8或cd4陽性和肽mhc四聚體陽性t細胞群。
93.權利要求92所述的方法，其中通過限制或連續稀釋，隨后是通過快速擴增方案擴增單個克隆來產生肽特異性免疫效應細胞的克隆群。
94.權利要求93所述的方法，其中所述方法還包括從所述肽特異性免疫效應細胞的克隆群克隆t細胞受體(tcr)。
95.權利要求94所述的方法，其中克隆所述tcr是克隆tcrα鏈和tcrβ鏈。
96.權利要求94或權利要求95所述的方法，其中所述tcr是使用5’-cdna末端快速擴增(race)方法來克隆的。
97.權利要求96所述的方法，其中所克隆的tcr被亞克隆到表達載體中。
98.權利要求97所述的方法，其中所述表達載體是逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。
99.權利要求97或98所述的方法，其中所述方法還包括用所述表達載體轉導宿主細胞以產生...
【專利技術屬性】
技術研發人員：余嘉誠，潘科，趙玉倫，
申請(專利權)人：得克薩斯州大學系統董事會，
類型：發明
國別省市：
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