【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物，尤其涉及耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體、分離方法及應用。
技術介紹
1、金黃色葡萄球菌(staphyloccocus?aureus)是一種常見的病原菌，可以引起多種局部和全身性感染疾病。金黃色葡萄球菌是引起動物乳房炎的主要致病菌之一，占乳腺內細菌感染的25～30％，金黃色葡萄球菌感染也是最難以治愈。現階段有效的防治方法主要有使用抗生素、噬菌體等。
2、噬菌體是感染細菌、真菌等微生物的病毒，噬菌體治療細菌性疾病具有很多優勢。代謝效率低、殺死細菌的最低劑量低、高度的特異性、高效的殺菌效果、克服細菌抗性的能力強、新型有效的噬菌體的篩選速度快。
3、金黃色葡萄球菌噬菌體在生產過程中，以粉劑為主要生產形式。通過冷凍干燥制備的噬菌體粉劑既可以提高噬菌體在長期儲存中的穩定性，然而成本高、能耗大。
4、噬菌體作為一種具有蛋白質外殼的活微生物，噬菌體產品的主要制造方法為高溫噴粉，在高溫生產過程中噬菌體熱應力會高度敏感，會造成噬菌體效價降低，甚至噬菌體失活，從而影響噬菌體產品的殺菌抑菌效果。
技術實現思路
1、為克服相關技術中存在的問題，本專利技術公開實施例提供了耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體、分離方法及應用。本專利技術目的在于提供一株耐高溫、具有高穩定性的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003，旨在解決金黃色葡萄球菌噬菌體粉劑生產過程中高溫導致的效價降低、治療金黃色葡萄球菌感染的乳腺炎效果下降的問題。
2、所述技術方
3、進一步，該噬菌體的核苷酸序列為seq?id?no.1。
4、進一步，該噬菌體在65℃-85℃條件下，活性大于107.5pfu/ml。
5、進一步，該噬菌體在ph2-13條件下，活性大于106pfu/ml。
6、進一步，該噬菌體在ph為7.0，活性大于109.8pfu/ml。
7、本專利技術的另一目的在于提供一種耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體在制備噬菌體粉劑中的應用。
8、本專利技術的另一目的在于提供一種耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體在制備預防和/或治療金黃色葡萄球菌引起的疾病的藥物中的應用。
9、本專利技術的另一目的在于提供一種耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體在制備生物殺菌劑、飼料添加劑中的應用。
10、本專利技術的另一目的在于提供一種根據所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體或其與醫學可接收的組合物混合在制備用于檢測、消毒醫療產品及食品防護產品上的應用，上述產品應用的形式包括以載體攜帶、濃縮注射或藥劑浸泡的形式適用于被防治的寄主體表、口部、直腸、胸膜內部部位；
11、載體攜帶形式包括口服含水性載體、口服無水性載體、乳膏制劑中的一種；
12、濃縮注射形式包括疫苗注射、胸膜腔注射、靜脈注射中的一種；
13、藥劑浸泡形式包括氣霧劑、漂洗劑中的一種。
14、本專利技術的另一目的在于提供一種耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體的分離方法，包括：
15、s1，致病性金黃色葡萄球菌的分離；
16、s2，污水樣處理：從發病的養殖場采取糞便樣本，加入生理鹽水浸泡過夜；將過夜后的浸出液離心，取上清液用濾器過濾，將濾出液保存備用；
17、s3，噬菌體富集：取金黃色葡萄球菌菌懸液和濾液加入lb液體培養基中，振蕩培養過夜，離心，將上清液用濾器過濾，濾出液備用；進行二次富集培養，得到二次富集后的濾液；
18、s4，噬菌體分離：采用雙平板法進行噬菌體的分離，取宿主金黃色葡萄球菌菌懸液與軟瓊脂混合均勻鋪在倒有lb固體的lb平板上；待軟瓊脂凝固后將二次富集后的濾液點到平板上，放于培養箱培養過夜后，用接種環挑取透明噬菌斑置于sm緩沖液中讓噬菌體完全釋放；
19、s5，噬菌體純化與制備：取過夜保存的噬菌體液進行梯度稀釋，分別和菌懸液混合，加入冷卻的軟瓊脂混合均勻，鋪雙平板，培養過夜純化，得純化好的噬菌體；將純化好的噬菌體浸泡液與菌液混合加入到lb液體中，搖床過夜培養，離心過濾，將噬菌體濾液中加入甘油混合后保存。
20、結合上述的所有技術方案，本專利技術所具備的優點及積極效果為：
21、1.本專利技術分離了一株禽金黃色葡萄球菌，并以該金黃色葡萄球菌為宿主分離得到了噬菌體rkp-sr-22003，該噬菌體rkp-sr-22003對養殖環境中禽金黃色葡萄球菌具有強裂解效用，為工業化生產噬菌體用于養殖環境中禽金黃色葡萄球菌的防治提供了良好的噬菌體來源。
22、2.在本專利技術中，噬菌體rkp-sr-22003在ph為7.0時，噬菌體效價最高；在ph為2～13的范圍內效價均處于較高水平，可見噬菌體rkp-sr-22003能耐受弱酸和弱堿條件，具有良好的酸堿耐受性。
23、3.本專利技術得到的噬菌體在高溫65～85℃范圍內效價保持較高水平，具有很好的耐高溫特性。
24、4.本專利技術的金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003在傳代過程中，可保持較高的穩定性，而高穩定性對于連續的生產使用具有重要的意義。
25、5.本專利技術的金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003可以單獨或混合使用，用作為生物殺菌劑，飼料添加劑，或因金黃色葡萄球菌引起的細菌感染的治療藥物、保健品及醫療器械；金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003可應用于治療或預防由金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病。
26、6.本專利技術的金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003可以應用于工業生產，其耐高溫的屬性，賦予了金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003可應用于噬菌體粉劑生產，并具有良好的防治效果。
27、7.本專利技術的金黃色葡萄球菌噬菌體rkp-sr-22003或其組合物制備成應用于醫療，檢測，消毒及食品防護等方面的各種產品加以工業應用。產品形式可包括但不限于以載體攜帶、濃縮注射或藥劑浸泡等形式施用于被防治的寄主體表、口部、直腸、胸膜內部等部位；載體攜帶形式包括但不限于口服含水性載體、口服無水性載體、乳膏制劑等；濃縮注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、靜脈注射等；藥劑浸泡形式包括但不限于氣霧劑、漂洗劑等。
28、作為本專利技術的權利要求的創造性輔助證據，還體現在以下幾個重要方面：
29、1.本專利技術所提供的噬菌體將對動物乳腺炎具有很好的預防和治療效果，提高動物的產奶質量，進而促進動物的機體健康和提升養殖場的效益。
30、2.本專利技術利用耐高溫噬菌體進行治療動物乳房炎，填補了該領域的技術空白。
31、3.噬菌體治療是全球倡導本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體命名為RKP-SR-22003，于2023年03月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?No.45444，分類命名為：金黃色葡萄球菌噬菌體，檢測結果為：存活。
2.根據權利要求1所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。
3.根據權利要求1所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體在65～85℃條件下，活性大于107.5pfu/mL。
4.根據權利要求1所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體在pH為2～13條件下，活性大于106pfu/mL。
5.根據權利要求1所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體，其特征在于，該噬菌體在pH為7.0條件下，活性大于109.8pfu/mL。
6.一種根據權利要求1～5任意一項所述的耐高溫的烈性金黃色葡萄球菌噬菌體在制備噬菌體粉劑中的應用。
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