【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種fgf21基因修飾的臍帶間充質干細胞外泌體制備、純化濃縮的方法。
技術介紹
1、exosome(外泌體)是細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑約為30-150nm之間，具有典型的脂質雙分子層膜結構，可存在于細胞培養(yǎng)上清液、血漿、血清、唾液、尿液、羊水和惡性腹水以及其它生物體液中；其攜帶有母細胞的多種蛋白質、脂類、dna和rna等重要信息，在細胞-細胞間的物質和信息傳遞中起重要作用。
2、間充質干細胞(mscs)是廣泛存在于多種組織和器官中，具有自我更新與多種分化潛能的一種前體細胞。間充質干細胞除具備分化潛能，還大量分泌外泌體和多種生物分子，包括細胞因子、趨化因子和生長因子。目前研究認為間充質干細胞在修復中的有益作用大部分歸因于旁分泌信號，也就是外泌體的作用。特別在最新的幾項研究中表明，由間充質干細胞分泌的外泌體可以替代間充質干細胞直接療法，例如msc衍生的外泌體(間充質干細胞外泌體)已經表現(xiàn)在傷口愈合和心肌梗塞的小鼠模型中可誘導自身修復，同樣的效果發(fā)生在神經、呼吸、軟骨、腎臟、心臟和肝臟疾病、骨修復和癌癥等等領域。
3、源自于間充質干細胞內分泌的外泌體，富含一百多種胞外基質蛋白，mrna信使核糖核酸和多重生長因子。在臨床上，干細胞外泌體主要治療燒傷、燙傷、皮膚潰瘍，再生健康皮膚；在護膚方面，主要是對外傷受損、衰老中毒皮膚進行修復，全面調理皮膚、改善膚質，令肌膚恢復年輕、健康的狀態(tài)。
4、外泌體與免疫反應、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經系統(tǒng)相關疾病和癌癥進展有
5、成纖維細胞生長因子-21(fgf21)是一種新近發(fā)現(xiàn)的內分泌激素，主要由肝臟產生，在脂肪組織、胰腺和骨骼肌中也有表達，可被分泌入血，參與調節(jié)機體的代謝。fgf21的生理作用主要在降低血糖和改善血脂方面。研究發(fā)現(xiàn)fgf21通過改善胰島素抵抗、增加糖異生和酮體產生等方式參與調節(jié)機體的血糖代謝。fgf21也參與了血脂代謝的調節(jié)，可以優(yōu)化脂蛋白譜。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病的核心，能直接改善胰島素抵抗的fgf21因此被醫(yī)藥界寄予了厚望，成為2型糖尿病新藥研發(fā)的熱點。
6、但是，fgf21被應用于臨床存在很大的障礙。野生型的fgf21(fgf21?wt)因易聚集、易被蛋白酶水解等特性，在體內半衰期非常短，不能直接應用于臨床?；谕饷隗w的。外泌體是由細胞內多泡體(multivesicular?body，mvb)與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的膜性囊泡，可以運輸豐富的蛋白質、脂質、dna和rna等物質。作為實現(xiàn)藥物或基因的傳遞，重要的是載體類型，外泌體載體綜合了細胞藥物遞送和納米技術的優(yōu)勢：(1)外泌體在血液中表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性，能夠在生理和病理條件下在體內進行長距離傳遞；(2)外泌體具有親水性核心，適合容納可溶性藥物；(3)外泌體是納米級的，并攜帶細胞表面分子，具有克服各種生物屏障的能力，并且具有天然的靶向能力；(4)外泌體的免疫原性非常低。
7、外泌體的一個關鍵問題是，如何獲得高產量純的外泌體。外泌體的未來研究很可能集中在提高外泌體分離純化效率、增強外泌體靶向特異性以及擴大外泌體治療應用上。用于外泌體表征和量化的標準化方案的開發(fā)也是研究的一個關鍵領域。
技術實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術的不足，本專利技術提供一種fgf21基因修飾的臍帶間充質干細胞外泌體制備、純化濃縮的方法，實現(xiàn)以下專利技術的目的：提供高產量的外泌體的制備方式；提供外泌體的純化濃縮方法。
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術公開了以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種含fgf21的外泌體的制備方法，包括以下步驟：
4、s1，將臍帶處理得華通氏膠，取華通氏膠剪碎，得華通氏膠組織塊；
5、s2，將華通氏膠組織塊于培養(yǎng)基中，通過組織貼壁法培養(yǎng)8-12天，得到初代臍帶間充質干細胞；
6、s3，將所述初代臍帶間充質干細胞培養(yǎng)3-5天為第二代，重復培養(yǎng)操作4次，得到p5代臍帶間充質干細胞；
7、s4，取含有fgf21表達載體的慢病毒，所述慢病毒按≥25mois感染復數(shù)與所述p5代臍帶間充質干細胞混合，并加入助感染劑，混合均勻，離心，培養(yǎng)≥24小時，得病毒感染的臍帶間充質干細胞；
8、s5，取所述病毒感染的臍帶間充質干細胞接種至培養(yǎng)基，培養(yǎng)≥72小時，收集培養(yǎng)基的上清液a；
9、s6，步驟s5收集完上清液a后重新加入新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)≥24小時，收集培養(yǎng)基的上清液b，將上清液a、b混合，得到含fgf21外泌體原液；
10、s7，將所述含fgf21外泌體原液經過超濾濃縮，濃縮至≥10倍后，用生理鹽水進行置換，最后過濾除菌，得含fgf21的外泌體；
11、所述fgf21為seq?id?no:1所示的氨基酸序列。
12、進一步地，所述培養(yǎng)基為干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)條件為在≥37℃、co2≥5％條件下培養(yǎng)。
13、進一步地，所述含有fgf21表達載體的慢病毒的滴度為＞1×109tu/ml。
14、進一步地，所述助感染劑為polybrene助感染劑，濃度為≥10μg/ml。
15、進一步地，所述步驟s7中過濾為≤0.22μm真空抽濾。
16、進一步地，所述超濾濃縮為用≥200cm2、孔徑為100kd的切向流超濾膜包，流速≤30ml/min進行超濾濃縮。
17、進一步地，所述過濾除菌為用≤0.22μm濾膜過濾除菌。
18、更進一步地，所述干細胞培養(yǎng)基為間充質干細胞無血清培養(yǎng)基。
19、第二方面，本專利技術提供了一種含fgf21的外泌體，根據第一方面所述的含fgf21的外泌體的制備方法制備而成。
20、本專利技術的有益效果：
21、1.通過慢病毒表達載體成功使間充質干細胞表達目標因子fgf21；
22、2.通過濃縮純化獲得濃度、純度更高的富含fgf21因子的外泌體。
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1.一種含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)條件為在≥37℃、CO2≥5％條件下培養(yǎng)。
3.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述含有FGF21表達載體的慢病毒的滴度為＞1×109TU/ml。
4.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述助感染劑為polybrene助感染劑，濃度為≥10μg/ml。
5.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述步驟S7中過濾為≤0.22μm真空抽濾。
6.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述超濾濃縮為用≥200cm2、孔徑為100KD的切向流超濾膜包，流速≤30ml/min進行超濾濃縮。
7.根據權利要求1所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述過濾除菌為用≤0.22μm濾膜過濾除菌。
8.根據權利要求2所述的
9.一種含F(xiàn)GF21的外泌體，其特征在于，根據權利要求1-8任一所述的含F(xiàn)GF21的外泌體的制備方法制備而成。
...【技術特征摘要】
1.一種含fgf21的外泌體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的含fgf21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)條件為在≥37℃、co2≥5％條件下培養(yǎng)。
3.根據權利要求1所述的含fgf21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述含有fgf21表達載體的慢病毒的滴度為＞1×109tu/ml。
4.根據權利要求1所述的含fgf21的外泌體的制備方法，其特征在于，所述助感染劑為polybrene助感染劑，濃度為≥10μg/ml。
5.根據權利要求1所述的含fgf21的外泌體的制備方法，其特征在于，所...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：杜永彪，安鴻，鐘浩，李增寶，
申請(專利權)人：康儲科技廣東有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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