【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生態環境、基因工程及分子生物，具體涉及一種aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用。
技術介紹
1、在科技快速發展的當代社會，如何實現經濟發展與環境保護齊頭并進成為了亟需解決的問題。尤其是重工業的快速發展，導致污水難以及時得到有效處理，所造成的環境惡化引起了人們的重視。一方面，工業廢水流入江河湖泊，會導致水生動植物的死亡。另一方面，工業廢水還有可能滲透到地下，污染農作物的生長環境。因此，解決這樣的重金屬污染是重中之重。
2、銅是天然存在的微量金屬之一，能夠幫助維持細胞穩態，是植物生長發育的必需微量營養素，也是生物體代謝中必不可少的營養元素，可以作為許多酶的輔助因子參與活性調節，比如細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶等。然而，植物中的銅如果過量則會破壞許多生物過程，例如蛋白質和酶的功能障礙，并損害體內的礦物質穩態，此外，銅也會破壞植物的dna的結構并引起染色體畸變。銅在人體內的過量會導致嚴重的氧化應激并造成人體組織的損傷，攝入被銅污染的水源會使人產生腹痛、惡心、頭疼、嘔吐等癥狀。當人體一次攝入大量銅導致銅在組織中過載時，會引發威爾遜氏病(wilson's?disease)，這是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝病，會導致銅介導氧化損傷并使細胞死亡，泄露的銅進入血液并最終在肝外組織中積累，導致肝衰竭。除此以外，大腦特定區域銅過量可能會導致一些神經退行性疾病的發生，例如阿爾茲海默癥(alzheimer's?disease)、克雅氏病(creutzfeldt–jakob?disease)以及肌萎縮側索硬化癥(am
3、生物修復能夠利用生物本身的生物學機制，從生態系統中去除環境污染物，包括直接吸附環境中的重金屬以及氧化還原反應來降低重金屬的污染。植物和微生物都是良好的生物修復的物種。植物能夠將土壤中的重金屬封存、區室化，并通過細胞絡合和金屬螯合對金屬進行解毒。而微生物具有強大的細胞代謝，通過呼吸與共代謝途徑，能夠利用環境中有毒化合物作為維持生存的能量來源，微生物已經進化了多種途徑來抵御金屬污染。生物修復法彌補了物理吸附法與化學沉淀法存在的一些弊端。有研究表明，微藻利用谷胱甘肽、植物螯合素和金屬硫蛋白抵御重金屬毒性。
4、萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)是一種綠色藻類譜系的單細胞綠藻，具有高細胞分裂率，是研究藻類生物學最發達的參考生物之一。萊茵衣藻還可以在條件簡單的培養基中生長到高細胞密度，并且很容易通過各種方式使其出現金屬過量或超載的情況，再通過監測某些金屬相關基因的表達來評估其生長狀況。萊茵衣藻能夠通過胞內的重金屬結合因子降低重金屬對細胞的毒害，包括植物螯合肽、硫氧還蛋白、谷胱甘肽等大分子物質。此外，銅的毒性作用通常被認為是通過產生活性氧對細胞造成損害，而萊茵衣藻能夠通過抗氧化物質抵御這樣的損害。目前，對于萊茵衣藻富集重金屬的途徑以及相關的調控方法等方面并未完全弄清楚，特別是對重金屬抗性相關的蛋白和調控機制的分析在國內的研究還比較少見。
5、在基因組學研究不斷進步的當下，萊茵衣藻作為模式生物被廣泛應用于轉基因技術，構建新的突變品種。通過篩選突變株進一步鑒定與重金屬抗性有關的基因成為研究衣藻重金屬抗性的一個有效方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，旨在提高萊茵衣藻藻株在生產實際的重金屬含銅廢水中的耐受性，以增加其生物量及吸附效率，從而提高生物修復含銅廢水的能力。此外，本專利技術還可為后續深入研究aida基因如何影響衣藻內部各種氧化應激反應及金屬轉運、代謝相關蛋白的表達與活性及相關脅迫細胞器功能提供了便利，后期將為萊茵衣藻重金屬銅代謝機制的理論研究及重金屬生物修復的應用研究奠定堅實的基礎。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：
3、aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述aida基因的核苷酸序列如seq?id?no?1所示，所述aida基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
4、進一步的，所述aida基因的編碼區能編碼aida蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如seq?id?no?2所示；所述aida蛋白質的氨基酸序列如seq?id?no?3所示。
5、進一步的，為了實現aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，實施方案包括以下步驟：
6、(1)構建野生型萊茵衣藻突變體文庫，將抗性基因片段aphviii隨機整合入衣藻基因組，造成隨機插入突變；
7、(2)通過銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法，篩選目標藻株，提取突變體細胞的基因組；
8、(3)利用resda-pcr技術擴增突變位點序列，測序及萊茵衣藻基因組數據庫比對，發現aphviii片段插入aida基因3’utr區域。所述萊茵衣藻基因組數據庫為，數據庫版本為chlamydomonas?reinhardtii?v5.6，網址為，https://phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search。
9、由此獲得本專利技術所述aida基因突變型萊茵衣藻藻株，經銅離子生長曲線及吸附效率的測定，發現突變型藻株的生長速率更快，且具有較高的銅離子耐受性；同時顯示突變型藻株對于銅離子的吸附效率具有一定的提高。
10、優選的，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphviii為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。該基因為廣泛應用于萊茵衣藻細胞株中的篩選基因片段。
11、進一步的，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為在400μm?cu2+的tap平板上將隨機突變轉化子涂布其中，篩選候選突變型藻株。
12、進一步的，步驟(3)中，所述resda-pcr技術所用的擴增引物為，第一輪pcr反應所用引物為特異引物outer-r和四個簡并性引物degalu?i、degtaq?i、degsac?ii、degpst?i；第二輪pcr反應所用引物為特異引物inner-r和簡并引物上特異結合位點引本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述Aida基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No?1所示，所述Aida基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
2.根據權利要求1所述的Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，所述Aida基因的編碼區能編碼Aida蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如SEQ?ID?No?2所示；所述Aida蛋白質的氨基酸序列如SEQ?ID?No?3所示。
3.根據權利要求1所述的Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphVIII為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。
5.根據權利要求3所述的Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為在400μM?Cu2+的TAP平板上將隨機突變轉化子涂布其中，篩選候選突變型藻株。
6.
7.根據權利要求3所述的Aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(3)中，所述RESDA-PCR技術所設置的第一輪PCR反應程序為：
...【技術特征摘要】
1.aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，所述aida基因的核苷酸序列如seq?id?no?1所示，所述aida基因的插入突變能夠提高萊茵衣藻對銅離子脅迫的耐受性。
2.根據權利要求1所述的aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，所述aida基因的編碼區能編碼aida蛋白質，該編碼區的核苷酸序列如seq?id?no?2所示；所述aida蛋白質的氨基酸序列如seq?id?no?3所示。
3.根據權利要求1所述的aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(1)中，所述抗性基因片段aphviii為萊茵衣藻常規抗性篩選基因片段，具有巴龍霉素抗性。
5.根據權利要求3所述的aida基因在萊茵衣藻對銅離子脅迫耐受性中的應用，其特征在于，步驟(2)中，所述銅離子耐受/吸附的藻株細胞篩選方法為在400μm?cu2+的tap平...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王亮，李亞，蔣林，徐闖，王蘇慧，錢蘊瑤，吳怡瓊，董周舟，師媛媛，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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