一種高效降解木質素的菌種及其應用制造技術

本發明專利技術涉及微生物菌種的篩選、純化和鑒定方法及其應用，特別是涉及高效降解木質素菌種的篩選純化，以及培養該高效降解木質素菌種的方法及其應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物菌種的篩選、純化和鑒定方法及其應用，特別是涉及高 降解木質素菌種的篩選純化，以及培養該高效降解木質素菌種的方法及其應用。
技術介紹
木質素是植物中含量僅次于纖維素的一種豐富的大分子次生代謝產物。據 估算，世界每年可由植物產生約600萬噸木質素。木質素具有重要的生物學功能。 在木質化過程中，木質素滲入到細胞壁，以提高植物體的機械強度；木質素由于 具有疏水性而有利于疏導組織的水分運輸；木質素還有利于植物體抵抗病菌微生 物等不良外界環境的侵襲。然而，木質素的存在并不利于人類的某些重要經濟用 途，尤其是在制槳造紙工業中，制漿造紙的中心環節是利用大量的化學品將原料 中的木質素與纖維素分離，纖維素用于造紙，而分離的木質素形成造紙廢液，造 成嚴重的環境污染，且脫木質素的化學藥品投入及廢液的堿回收處理大大增加了 造紙成本。在自然界中，大多微生物個體雖然個體微小，但生長旺盛繁殖快，若其具 有降解木質素能力，將能有效的降解木質素。目前發現的能降解木質素的微生物 主要是真菌，根據真菌降解木材時引起其性狀變化不同，將它們分為白腐真菌， 褐腐真菌和軟腐真菌。白腐真菌降解木質素能力一般高于降解纖維素能力，其他 兩種降解木質素能力弱于降解纖維素能力。關于真菌能夠降解木質素，大多認為 其能產生能一些降解木質素酶。目前，研究比較多，降解能力較強的酶有三種， 即木質素過氧化物酶(Lignin Peroxidase/Lip)、錳依賴過氧化物酶(Manganases peroxidase/Mnp)和漆酶(lacase)。除了上述3種重要的酶外，其他的如葡萄糖 氧化酶、過氧化氫酶及一些還原酶和蛋白酶等都參與或對木質素的降解有一定的 影響b近年來，某些真菌降解木質素己開始應用于工業生產和環境處理。如黃原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已應用于造紙工業中的生物制漿，生 物漂白等過程。Setliff利用真菌對楊木進行了預處理，結果表明，與未經真菌處 理相比，在盤磨機磨至相同游離度的情況下，楊木可以降低20%的能耗。用木質素降解菌處理飼料可提高動物對飼料的消化，并且已經突破了秸稈 僅用于反芻動物飼料的禁區，對飼養豬、雞的實驗效果已有報道。而且秸稈可以 轉化為有機肥料，但自然轉化的過程較長，應用白腐菌可以加快它的轉化速度。 此外，木質素降解菌還可以應用于污水處理，土壤恢復等領域。目前研究及應用的菌種存在對木質素降解的特異性和活性不足等缺點，因 此，篩選產酶量高、抗性強的菌種，從而改進生產工藝是國內外研究的主要熱點。 本實驗從長白山腐朽的木材中篩選獲得了能較強降解木質素的菌種，其在造紙 業，畜牧業，以及環境保護等方面具有很大意義。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種篩選獲得高活性的降解木質素的菌種的方 法，該方法包括利用馬鈴薯培養基進行培養獲得單克隆菌株，而后利用苯胺蘭平 板、分光光度計、木質素平板、纖維素培養液以及紫穗槐木材中實際測試從而獲 得對木質素降解能力強而對纖維素降解能力弱的菌種。本專利技術的另一個目的是提供高活性的降解木質素的菌種，其特征在于生長 繁殖迅速，對木質素降解能力強而對纖維素降解能力很弱。目前， 一些降解木質素的微生物已開始應用于工業生產和環境處理。如黃 原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已應用于造紙工業中的生物制漿, 生物漂白等過程。Setliff利用真菌對楊木進行了預處理，結果表明，與未經真菌 處理相比，在盤磨機磨至相同游離度的情況下，楊木可以降低20%的能耗。用木 質素降解菌處理飼料可提高動物對飼料的消化。而且秸稈可以轉化為有機肥料,但自然轉化的過程較長，應用白腐菌可以加快它的轉化速度。此外，木質素降解 菌還可以應用于污水處理，土壤恢復等領域。本專利技術將取材于長白山的質地松軟的腐朽木材用無菌的蒸餾水沒過浸泡兩 小時，然后將取200微升液體均勻涂到馬鈴薯培養板(PDA)上，28r培養2 天，選取不同位置的菌落于選擇培養基上多次劃板傳代，獲得單克隆菌株。本專利技術在獲得多株單克隆菌株后，繼而采用下述方法進行了菌種的篩選， 從而獲得了具有高活性木質素能力而對纖維素降解活性低的菌種。首先使用苯胺蘭法初步選擇菌種，將菌種分別接種到選擇培養板苯胺蘭平 板上進行培養，觀察不同天數脫色情況，選出脫色能力強的菌種。我們在實驗中 以水為空白分別對苯胺蘭溶液和未加苯胺蘭的選擇培養液進行全波長掃描，發現 苯胺蘭溶液在625nrn處有吸收峰而未加苯胺蘭的培養液在此處無吸收，故選擇 625nm測定不同濃度的苯胺蘭溶液的吸光度，做出標準曲線，求得線形回歸方程。 將不同克隆的菌種接種到含苯胺蘭的培養液中，培養五天，測定降解的苯胺蘭的 量。選出降解能力強的菌種。將苯胺蘭法篩選出來的菌種接種到以木質素作為唯一碳源的培養基上，觀 察不同天數的生長狀態，定性的確定其利用木質素的能力強弱。在此基礎上，我們進一步利用纖維素法對菌種進行進一步篩選。將濾紙剪 成0.6cmX1.6cm的濾紙條，加缺碳源的培養液10ml，高壓滅菌后，接種有較高 降解木質素能力的菌種，空白管為含濾紙片的培養液，置于28'C搖床里150轉 震蕩培養，定時觀察濾紙崩潰情況，崩解速度越快降解纖維素能力越強，反之亦 然。從而初步獲得對木質素降解能力強而對纖維素降解能力很弱的菌種。在初步獲得較理想的菌種后，我們利用紫穗槐木材對我們篩選獲得的菌種 進行了實際測試。將紫穗槐枝條去皮，烘干，削成碎片，準確稱量，高壓滅菌， 接種前幾步曬選出來的菌種，空白對照為不接種的菌的紫穗槐，陽性對照為購自 廣東微生物所的白腐菌GIM3.383， GIM3.393培養環境保持濕潤。對每一菌種降 解的紫穗槐在不同天數時用酸不溶解木質素提取方法提取木質素，計算其降解木 質素以及纖維素的量，篩選出降解纖維素很弱而降解木質素很強的菌種。重復該 實驗。結果顯示本專利技術所獲得的菌種具有高降解木質素的活性和很低的降解纖維 素的活性，其性能優于上述購買的對照菌種。本專利技術的這些研究結果將會為該菌 種在造紙工業中的應用提供基礎。具體實施例方式以下借助實施例描述本專利技術的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡 明本專利技術，而不是以任何方式限制本專利技術待批權利要求的范圍。 實施例l:菌種分離與純化(1) 培養基的配制馬鈴薯培養基(PDA):馬鈴薯200g去皮，切成小塊煮沸30min，然后用 紗布過濾，濾液中再加蔗糖20g，瓊脂15g，補水至1000ml。 115。C滅菌20min。(2) 菌種的分離與純化將取材于長白山的質地松軟的腐朽木材置于50毫升無菌離心管中，用無菌 的蒸餾水沒過浸泡兩小時，然后將取200微升液體均勻涂到馬鈴薯培養板(PDA) 上，28。C培養2天，再從長出的菌中，用接種環挑取不同位置的20-40個菌落至 馬鈴薯培養基平板劃線，將平板置于28'C培養2天，重復該步驟至少2次，獲 得單克隆菌株。實施例2:苯胺蘭法初步選擇菌種(1) 苯胺蘭平板法真菌降解木質素一般是由于該菌產生了LiP及MnP等 可以降解木質素的酶，這些酶可以使得染料苯胺蘭脫色，因此可以用來監測氧化 物型木質素酶，本實驗采用苯胺蘭平板法對菌種進行初步篩選。將菌種分別接種 到選擇培養板苯胺蘭平板上進行培養本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高活性的降解木質素的菌種，其特征在于生長繁殖迅速，對木質素降解能力強而對纖維素降解能力很弱。

【技術特征摘要】
1.一種高活性的降解木質素的菌種，其特征在于生長繁殖迅速，對木質素降解能力強而對纖維素降解能力很弱。2. 按照真菌鑒定的方法，對權利要求l中的菌種進行生理生化鑒定，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：顏煒群，張新民，
申請(專利權)人：吉林圣元科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：82[中國|長春]