【技術實現步驟摘要】
本專利技術專利涉及一種用于同時分析單個細胞內基因組和轉錄組的功能化微球、其制備方法及試劑盒，屬于生物工程。
技術介紹
1、單細胞測序技術是近些年發展而來的新的測序技術，單細胞測序是指在單個細胞水平上對細胞內的所有核酸序列(包括基因組和轉錄組)進行測序和分析，包括單細胞dna測序和單細胞rna測序。其解決了傳統bulk測序所不能解決的細胞異質性問題，可以揭示細胞間的遺傳信息差異，發現新的細胞類型和新型細胞標志物。早在2009年，來自北京大學生命科學學院的湯富酬教授就在nature?methods發表文章，首次將單細胞轉錄組擴增和ngs技術相結合，成功的對單個細胞內的全轉錄組進行測序，但是這種針對單個細胞建庫測序的技術成本昂貴，難以商用，嚴重限制了單細胞測序技術的應用和發展。
2、2015年左右發展起來的高通量的單細胞測序技術可以實現同時對成千上萬個細胞進行測序和分析，單細胞測序技術獲得飛速發展。高通量的單細胞測序技術目前主流的技術平臺有微孔(microwell)、微液流(microfluidic)和微液滴(droplet)三種，而基于微孔板和微液滴技術商業化最成功的例子是bd?rhapsody和10x?genomics?next?gemchromium平臺，后者技術更為成熟，細胞的捕獲通量相對更高，逐漸成為目前主流的高通量單細胞測序技術。
3、但是基于微液滴技術的單細胞測序目前依然存在著諸多問題，例如用于實現對單個細胞進行標記的最核心的微珠目前的功能過于單一化，只能實現單一領域的應用，無法實現多組學的測序和
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案為：
2、一種用于同時分析單個細胞內基因組和轉錄組的功能化微球，在功能化微球的表面修飾有兩種特定序列的單鏈寡核苷酸分子，其中第一特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第一通用引物、細胞標簽、基因組捕獲序列，第二特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第二通用引物、細胞標簽、數字分子標簽和轉錄組捕獲序列，所述細胞標簽為任意dna序列，其中同一微球上的細胞標簽序列相同，不同微球上的細胞標簽序列不同，用于標記不同細胞。
3、優選的，所述細胞標簽長度為16-38bp。
4、優選的，所述基因組捕獲序列為cgcgtctg；和/或所述轉錄組捕獲序列為poly(dt)vn，poly(dt)代表20-30個t；
5、n為a、t、c、g任意四種堿基之一，v為a、c、g三種堿基之一。
6、優選的，所述第一通用引物的序列為aatgatacggcgaccaccgagatctacac；第二通用引物的序列為ctacacgacgctcttccgatct。
7、優選的，所述細胞標簽的序列為x-linker1-y-linker2-z，其中x、y、z代表6-8bp的任意dna序列，所述linker1的序列為ctgt，linker2的序列為acag；所述linker1或linker2為細胞標簽序列的各段(x、y、z)的連接提供橋梁，其選擇不受本專利技術的限制。優選的，linker1或linker2序列不要有連續2個以上的重復堿基，連續2個以上的重復堿基會降低連接效率。優選的，所述linker1的序列為ctgt，linker2的序列為acag；
8、數字分子標簽序列為(n)8-12，代表8-12bp的任意dna序列，同一微球上每條第二特定序列的單鏈寡核苷酸分子的數字分子標簽序列均不同，用于統計捕獲的轉錄組數量。
9、優選的，所述微球為聚丙烯酰胺凝膠微珠。
10、本專利技術還公開了上述的功能化微球的制備方法，其步驟包括：
11、(1)分別獲得所述第一通用引物、第二通用引物、所述細胞標簽序列、所述數字分子標簽序列、所述第一捕獲序列、所述第二捕獲序列；
12、(2)合成聚丙烯酰胺凝膠微珠，合成的同時加入所述第一通用引物、第二通用引物，使所述第一通用引物、第二通用引物偶聯到聚丙烯酰胺凝膠微珠上；
13、(3)將步驟(2)獲得的聚丙烯酰胺凝膠微珠上的所述第一通用引物或所述第二通用引物的末端，依次連接所述細胞標簽序列、所述數字分子標簽序列、所述基因組捕獲序列或所述轉錄組捕獲序列；獲得修飾有兩種特定序列的單鏈寡核苷酸分子的聚丙烯酰胺凝膠微珠。
14、本專利技術還公開了上述的功能化微球的更具體的制備方法，其步驟包括：
15、(1)分別合成bc1a、bc1b、bc2、bc3a、bc3b，以及與bc1a、bc1b、bc2、bc3a、bc3b分別對應的輔助夾板互補序列bc1a-rc、bc1b-rc、bc2-rc、bc3a-rc、bc3b-rc，將bc1a、bc1b、bc2、bc3a、bc3b分別與對應的輔助夾板互補序列混合后退火，得到具有雙鏈結構的dsbc1a、dsbc1b、dsbc2、dsbc3a、dsbc3b，將dsbc1a與dsbc1b混合到一起，命名為dsbc1-mix，將dsbc3a與dsbc3b混合到一起，命名為dsbc3-mix；合成uni?primer-1partial、uni?primer-2partial；
16、(2)合成聚丙烯酰胺凝膠微珠，合成的同時加入所述uni?primer-1partial、uniprimer-2
17、partial，使兩種通用引物偶聯到聚丙烯酰胺凝膠微珠上；
18、(3)將偶聯有兩種通用引物的聚丙烯酰胺凝膠微珠與所述dsbc1-mix、dna連接酶混合反應，得到兩種通用序列與兩種dsbc1即dsbc1a和dsbc1b相連接的聚丙烯酰胺凝膠微珠；
19、(4)將所述dsbc2、dna連接酶與步驟(3)獲得的聚丙烯酰胺凝膠微珠混合，將dsbc2連接到兩種dsbc1上；
20、(5)將所述dsbc3-mix、dna連接酶與步驟(4)獲得的聚丙烯酰胺凝膠微珠混合，將兩種dsbc3即dsbc3a和dsbc3b連接到dsbc2上；
21、(6)將步驟(5)獲得的聚丙烯酰胺凝膠微珠進行單鏈化處理，獲得修飾有兩種特定序列的單鏈寡核苷酸分子的聚丙烯酰胺凝膠微珠；
22、其中所述uni?primer-1partial的序列為：ctacacgacgctctt
23、所述uni?primer-2partial的序列為：aatgatacggcgaccaccgaga
24、所述bc?1a的序列：ccgatct(x)
25、所述bc?1b的序列：tctacac(x)
26、所述bc?2的序列：gtca(y)
27、所述bc?3a的序列：acag(z)(n)8-12poly(dt)vn；
28、所述bc?3b的序列本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于同時分析單個細胞內基因組和轉錄組的功能化微球，其特征在于：在功能化微球的表面修飾有兩種特定序列的單鏈寡核苷酸分子，其中第一特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第一通用引物、細胞標簽、基因組捕獲序列，第二特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第二通用引物、細胞標簽、數字分子標簽和轉錄組捕獲序列，所述細胞標簽為任意DNA序列，其中同一微球上的細胞標簽序列相同，不同微球上的細胞標簽序列不同。
2.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述細胞標簽的長度為16-38bp。
3.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述基因組捕獲序列為CGCGTCTG；
4.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述第一通用引物的序列為AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；第二通用引物的序列為CTACACGACGCTCTTCCGATCT。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的功能化微球，其特征在于：所述細胞標簽的序列為X-linker1-Y-linker2-Z，其中X、
6.根據權利要求5所述的功能化微球，其特征在于：所述linker1的序列為CTGT，linker2的序列為ACAG。
7.根據權利要求6所述的功能化微球，其特征在于：所述微球為聚丙烯酰胺凝膠微珠。
8.權利要求1-7中任一項所述的功能化微球的制備方法，其特征在于其步驟包括：
9.權利要求5-7中任一項所述的功能化微球的制備方法，其特征在于其步驟包括：
10.根據權利要求9所述的功能化微球的制備方法，其特征在于：所述BC1a-RC的序列為TGAC(X`)AGATCGGAAGAGCG；
11.根據權利要求9所述的功能化微球的制備方法，其特征在于：步驟(2)具體為將兩種通用引物的寡核苷酸與丙烯酰胺單體、胱胺交聯劑、過硫酸銨引發劑以及TEMED催化劑混合，然后通過微流控芯片和微滴微球制備儀生成預期大小的微液滴，然后加熱孵育，純化回收得到預期尺寸大小的聚丙烯酰胺凝膠微珠。
12.根據權利要求9所述的功能化微球的制備方法，其特征在于：步驟(3)、(4)、(5)中所用的DNA連接酶為T4?DNA連接酶。
13.一種同時分析單個細胞內基因組和轉錄組的試劑盒，其特征在于包括權利要求1-7中任一項所述的功能化微球。
...【技術特征摘要】
1.一種用于同時分析單個細胞內基因組和轉錄組的功能化微球，其特征在于：在功能化微球的表面修飾有兩種特定序列的單鏈寡核苷酸分子，其中第一特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第一通用引物、細胞標簽、基因組捕獲序列，第二特定序列的單鏈寡核苷酸分子包括從5’端到3’端依次連接的第二通用引物、細胞標簽、數字分子標簽和轉錄組捕獲序列，所述細胞標簽為任意dna序列，其中同一微球上的細胞標簽序列相同，不同微球上的細胞標簽序列不同。
2.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述細胞標簽的長度為16-38bp。
3.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述基因組捕獲序列為cgcgtctg；
4.根據權利要求1所述的功能化微球，其特征在于：所述第一通用引物的序列為aatgatacggcgaccaccgagatctacac；第二通用引物的序列為ctacacgacgctcttccgatct。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的功能化微球，其特征在于：所述細胞標簽的序列為x-linker1-y-linker2-z，其中x、y、z代表6-8bp的任意dna序列，所述linker1和linker2為4-8bp的任意dna序列，且序列中沒有連續2個以上...
【專利技術屬性】
技術研發人員：常明星，劉珊珊，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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