【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法。
技術介紹
1、腫瘤類器官是從患者腫瘤組織中分離癌細胞并通過特定的生長因子組合在3d基質條件下構建形成的具有一定組織特征的培養物。目前，類器官培養中常規的培養方式為包埋法，即將分散的腫瘤細胞與基質膠進行混合后，以膠滴的形式對細胞團進行培養擴增，但對于消化道腫瘤組織來說，存在以下問題：
2、首先，腫瘤組織的常規的分離方式是基于組織的機械破碎與生物酶消化兩種方式或兩種方式聯合使用。為保證類器官形成以及減少由于消化過度引起的細胞死亡，消化分離的終點，通常以50μm左右的細胞團為最佳。但由于消化過程存在不可控因素，以及腫瘤組織因人而異的組織學特征，通常很難保證消化后產生的是以細胞團為主的混合物。該問題存在于所有類型的腫瘤組織消化中
3、其次，對于消化道腫瘤組織來說，切除部分可能存在正常具有分泌功能的細胞組成，胰蛋白酶、胃蛋白酶的存在可能導致組織細胞過度分散，單細胞以及死細胞的占比高，影響前期類器官的形成。
4、基于此本專利技術提供了一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，可以有效提高前期的類器官形成數量。
技術實現思路
1、本專利技術針對目前消化道腫瘤類器官的培養中，可以很明顯的觀察到在培養前期存在大量的細胞凋亡發生，最終的類器官形成率遠低于實際接種細胞的預期情況的問題，提供一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，具體包括以下步驟：
2、步驟一、取新鮮的消化道腫瘤組織，使用pbs清洗后，
3、步驟二、向組織碎片中加入組織消化液消化，短時多次消化，收集上懸液與細胞/組織沉淀；
4、步驟三、離心收集消化后的細胞/組織沉淀；
5、步驟四、將組織細胞接種至預制的基質膠頂部使用對應的類器官培養基進行培養；
6、步驟五、一段時間后轉至膠滴中包埋培養。
7、步驟一所述消化道腫瘤包括胃癌、胰腺癌、結直腸癌中的任意一種；
8、步驟一所述pbs清洗是將獲取的腫瘤組織放入離心管中，加入10倍體積的pbs搖晃清洗，并棄去上清；
9、步驟一所述的切碎是將腫瘤組織置于細胞培養皿上用手術刀切碎至0.5mm3的小塊。
10、步驟二所述消化是將腫瘤組織碎片置于離心管中，加入至少5倍體積的組織消化液，在恒溫搖床中，37℃，200rpm消化處理；
11、步驟二所述短時多次消化是指每次將消化時間控制在3-5分鐘，通過自然沉降收集上懸液并加入大比例pbs置冰上終止，補齊消化體系，重復上述步驟，直至組織大部分消化，僅剩少量的組織碎片。
12、步驟三所述的離心收集是將步驟二收集到的上懸液與剩余沉淀一同在4℃、250g條件下離心5分鐘，去除上清，獲得細胞/組織沉淀。
13、步驟四所述預制的基質膠是將基質膠與dmem(dulbecco's?modified?eaglemedium)按體積比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一層1mm的凝膠層；
14、步驟四所述的細胞接種是將步驟三收集到的細胞/組織沉淀用對應的含10％基質膠的類器官培養基重懸后，加入預制的基質膠頂部，使其自然分散；
15、步驟四所述的對應的類器官培養基是指胃癌組織使用胃癌類器官培養基，胰腺癌組織使用胰腺癌類器官培養基，結直腸癌組織使用結直腸類器官培養基；
16、步驟四所述的培養是指在37℃、二氧化碳含量5％的環境中進行培養。
17、步驟五所述的一段時間是指3-5天，在六孔板預制的基質膠中培養3-5天，過程中每2-3天進行一次換液。
18、步驟五所述的轉至膠滴中包埋是指吸去步驟四的培養上清，每孔加入3mldispase?ii(分散酶ii)，用巴斯德滴管將膠滴吹散，于37℃條件下孵育15-20分鐘，收集懸液，使用1ml吸頭吹打10-20次；4℃、250g條件下離心5分鐘，去上清，向細胞沉淀中加入稀釋的基質膠混勻，對應的類器官培養基與基質膠的體積比為1:2；按照每滴25-40μl的體積接種至細胞培養板中，37℃待膠滴凝固。
19、步驟五所述的培養是指加入對應的類器官培養基，在37℃、二氧化碳含量5％的環境中進行培養。
20、優選的所述步驟二中的組織消化液包括以下濃度的組分：200-500μg/mlcollagenase?ii、10-20μg/ml?dnaseⅰ、10-15nmol/ml?y-27632、1×glutamax和1×penicillin/streptomycin的advance?dmem/f12培養基。
21、優選的本專利技術所述胃癌類器官培養基包括以下濃度的組分：50％(v/v)wnt3a條件培養基、10％(v/v)r-spondin1條件培養基、100ng/ml?noggin、10μmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1％(v/v)n2、1％(v/v)b27、10μmol/mlnicotinamide、1μmol/ml?n-acetylcystein、50ng/ml?human?egf、0.01nmol/ml?gastrin?1和100μg/ml?plasmocin的advance?dmem/f12。
22、優選的本專利技術所述胰腺癌類器官培養基包括以下濃度的組分：50％(v/v)wnt3a條件培養基、10％(v/v)r-spondin1條件培養基、100ng/ml?noggin、10μmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1％(v/v)b-27、10μmol/ml?nicotinamide、1μmol/ml?n-acetylcystein、0.5nmol/ml?a83-01、0.01nmol/ml?gastrin?1、100ng/mlfgf10、50ng/ml?human?egf和25μg/ml?plasmocin的advance?dmem/f12。
23、優選的本專利技術所述結直腸癌類器官培養基包括以下濃度的組分：50％(v/v)wnt3a條件培養基、10％(v/v)r-spondin1條件培養基、100ng/ml?noggin、10μmol/ml?hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、2％(v/v)b27、10μmol/ml?nicotinamide、10μmol/ml?n-acetylcystein、0.5nmol/ml?a83-01、10nmol/ml?sb202190、50ng/ml?human?egf和100μg/ml?plasmocin的advance?dmem/f12。
24、使用本專利技術消化道腫瘤類器官培養方法進行胃、胰腺、結直腸在內的消化道腫瘤類器官培養，可以實現前期的細胞自發聚集組織，細胞間的信號傳導恢復以及拮抗損傷以及失巢引發的凋亡相關信本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟一所述消化道腫瘤包括胃癌、胰腺癌中的任意一種；
3.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟二所述消化是將腫瘤組織碎片置于離心管中，加入至少5倍體積的組織消化液，在恒溫搖床中，37℃，200RPM消化處理；
4.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟三所述的離心收集是將步驟二收集到的上懸液與剩余沉淀一同在4℃、250g條件下離心5分鐘，去除上清，獲得細胞/組織沉淀。
5.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟四所述預制的基質膠是將基質膠與DMEM按體積比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一層1mm的凝膠層；
6.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟五所述的一段時間是指3-5天，在六孔板預制的基質膠中培養3-5天，過程中每2-3天進
7.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，所述步驟二中的組織消化液包括以下濃度的組分：200-500μg/mL?Collagenase?II、10-20μg/mLDNAseⅠ、10-15nmol/mL?Y-27632、1×GlutaMAX和1×penicillin/streptomycin的advanceDMEM/F12培養基。
8.根據權利要求5所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，所述胃癌類器官培養基包括以下濃度的組分：50％(V/V)Wnt3a條件培養基、10％(V/V)R-spondin1條件培養基、100ng/mL?Noggin、10μmol/mL?HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1％(V/V)N2、1％(V/V)B27、10μmol/mL?nicotinamide、1μmol/mL?N-acetylcystein、50ng/mL?human?EGF、0.01nmol/mL?Gastrin?1和100μg/mL?Plasmocin的advance?DMEM/F12。
9.根據權利要求5所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，所述胰腺癌類器官培養基包括以下濃度的組分：50％(V/V)Wnt3a條件培養基、10％(V/V)R-spondin1條件培養基、100ng/mL?Noggin、10μmol/mL?HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1％(V/V)B-27、10μmol/mL?nicotinamide、1μmol/mL?N-acetylcystein、0.5nmol/mL?A83-01、0.01nmol/mL?Gastrin?1、100ng/mL?FGF10、50ng/mL?human?EGF和25μg/mL?Plasmocin的advance?DMEM/F12。
...【技術特征摘要】
1.一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟一所述消化道腫瘤包括胃癌、胰腺癌中的任意一種；
3.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟二所述消化是將腫瘤組織碎片置于離心管中，加入至少5倍體積的組織消化液，在恒溫搖床中，37℃，200rpm消化處理；
4.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟三所述的離心收集是將步驟二收集到的上懸液與剩余沉淀一同在4℃、250g條件下離心5分鐘，去除上清，獲得細胞/組織沉淀。
5.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟四所述預制的基質膠是將基質膠與dmem按體積比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一層1mm的凝膠層；
6.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，步驟五所述的一段時間是指3-5天，在六孔板預制的基質膠中培養3-5天，過程中每2-3天進行一次換液；
7.根據權利要求1所述的一種高效的消化道腫瘤類器官培養方法，其特征在于，所述步驟二中的組織消化液包括以下濃度的組分：200-500μg/ml?collagenase?ii、10-20μg/mldnaseⅰ、10-15nmol/ml?y-27632、1×glutamax和1×penicillin/streptomycin的advanc...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張妹，李俊輝，聶盼，黃璘，
申請(專利權)人：北京嘉士騰醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：
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