【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及外膜蛋白純化，具體涉及一種免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3膜外區(qū)蛋白的表達(dá)純化方法。
技術(shù)介紹
1、膜蛋白的體外表達(dá)純化是一個(gè)特別具有挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，這是由于膜蛋白具有高度的疏水性，因此選擇合適的表達(dá)體系對(duì)于成功表達(dá)膜蛋白至關(guān)重要。從表達(dá)體系上看，體外表達(dá)純化蛋白系統(tǒng)通?？梢苑譃樵吮磉_(dá)純化體系和真核表達(dá)純化體系。真核表達(dá)體系則包括酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，優(yōu)點(diǎn)是能夠進(jìn)行復(fù)雜的后翻譯修飾，更可能正確折疊復(fù)雜蛋白，但培養(yǎng)基和維護(hù)條件通常更為復(fù)雜和昂貴，相較于細(xì)菌，真核細(xì)胞的生長(zhǎng)速度更慢；原核表達(dá)體系通常指的是使用如大腸桿菌這樣的細(xì)菌來表達(dá)目標(biāo)蛋白，盡管原核體系可能無法正確折疊某些蛋白質(zhì)，且無法進(jìn)行復(fù)雜的后翻譯修飾(如糖基化)，但大腸桿菌等細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量蛋白質(zhì)，此外培養(yǎng)細(xì)菌所需的培養(yǎng)基和條件相對(duì)簡(jiǎn)單和便宜，而且基因工程和蛋白質(zhì)純化技術(shù)在細(xì)菌中的應(yīng)用相對(duì)成熟，使得操作更加簡(jiǎn)易。
2、免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3是b7家族免疫檢查點(diǎn)蛋白的一員，其在多種類型的腫瘤中過度表達(dá)，并通常與患者的不良預(yù)后相關(guān)。這種特征使得b7-h3成為當(dāng)前癌癥治療研究中的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。不同于正常組織，腫瘤組織中b7-h3的表達(dá)顯著增加，表明其可能在腫瘤發(fā)展和免疫逃逸中發(fā)揮重要角色(getu，a.a.，tigabu，a.，zhou，m.et?al.newfrontiers?in?immune?checkpoint?b7-h3(cd276)research?and?drug?development.molcancer?2
3、在這種背景下，成功獲得高產(chǎn)量且溶解性良好的b7-h3外膜區(qū)蛋白具有重要的生物學(xué)意義。這不僅有助于深入研究b7-h3的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，而且可能為開發(fā)針對(duì)b7-h3的抗癌治療策略提供關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。例如，純化的b7-h3外膜區(qū)蛋白可以用于免疫學(xué)研究，如免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的開發(fā)，或作為腫瘤疫苗的組分，進(jìn)而在癌癥免疫治療中發(fā)揮重要作用。此外，高質(zhì)量的b7-h3蛋白也是進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的重要資源，有助于揭示其與受體的相互作用機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)新的治療藥物提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
4、目前發(fā)現(xiàn)b7-h3有兩種存在形式：2ig-b7-h3和4ig-b7-h3。2ig-b7-h3表達(dá)于鼠與人的細(xì)胞中，有細(xì)胞外的igv-igc結(jié)構(gòu)；4ig-b7-h3僅表達(dá)于人細(xì)胞中，由串聯(lián)重復(fù)的igv-igc-igv-igc結(jié)構(gòu)組成。人類b7-h3的主要存在形式為4ig-b7-h3(zhou，y.h.，et?al.，4igb7-h3?is?the?major?isoform?expressed?on?immunocytes?as?well?as?malignantcells.tissue?antigens，2007.70(2)：p.96-104)。4ig-b7-h3主要表達(dá)在細(xì)胞表面，這表明其在免疫系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行直接的細(xì)胞間相互作用。因此，當(dāng)關(guān)注蛋白質(zhì)的可溶性形式(在細(xì)胞外釋放)時(shí)，研究通常集中在2ig-b7-h3亞型上。這是因?yàn)?ig-b7-h3亞型更有可能以可溶性形式存在于細(xì)胞外環(huán)境中，這對(duì)了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用至關(guān)重要。
5、目前b7-h3的可溶性蛋白只能通過在真核細(xì)胞中通過過表達(dá)再純化獲取，或者在原核表達(dá)體系通過變性、再?gòu)?fù)性的方式獲得帶gst標(biāo)簽的可溶性的2ig-b7-h3蛋白(zhanggb，chen?yj，shi?q，ma?hb，ge?y，wang?q，jiang?z，xu?y，zhang?xg.human?recombinantb7-h3?expressed?in?e.coli?enhances?t?lymphocyte?proliferation?and?il-10secretion?in?vitro.acta?biochim?biophys?sin(shanghai).2004?jun；36(6)：430-6.doi：10.1093/abbs/36.6.430.pmid：15188059)，前者存在成本較高、獲取蛋白量較低、細(xì)胞培養(yǎng)周期較長(zhǎng)的問題，后者存在操作繁瑣可溶性蛋白產(chǎn)量低、周期較長(zhǎng)、難以批量生產(chǎn)蛋白的問題。
6、vladimir?vigdorovich等人通過在果蠅s2細(xì)胞(真核體系)通過轉(zhuǎn)染的方式將鼠b7-h3基因的膜外區(qū)(氨基酸34-247，即2ig-b7-h3)在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，在進(jìn)行7天誘導(dǎo)表達(dá)后收獲鼠2ig-b7-h3膜外區(qū)蛋白(vigdorovich?v，ramagopal?ua，lázár-molnár?e，etal.structure?and?t?cell?inhibition?properties?of?b7?family?member，b7-h3.structure.2013；21(5)：707-717.doi：10.1016/j.str.2013.03.003)；young-hee?lee等人將b7-h3胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-316，即2ig-b7-h3)與鼠igg2a融合表達(dá)，通過將融合基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入293-f細(xì)胞(真核體系)，過表達(dá)四天后收獲2ig-b7-h3-migg2a?fc融合蛋白(lee，yh.，martin-orozco，n.，zheng，p.et?al.inhibition?of?the本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第一步中優(yōu)化的4Ig-B7-H3由金斯瑞生物公司取4Ig-B7-H3的胞外結(jié)構(gòu)域合成并經(jīng)過了密碼子優(yōu)化以便增加蛋白在原核表達(dá)體系的表達(dá)量及溶解性。
3.如權(quán)利要求2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述密碼子優(yōu)化后的4Ig-B7-H3的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示：
4.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第二步的宿主細(xì)胞為E.coli?Rosseta(DE3)。
5.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第三步中采用IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第三步進(jìn)一步具體為將重組的菌株轉(zhuǎn)接至30ml的卡納抗生素抗性的LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱以37℃，220rpm轉(zhuǎn)速
7.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第四步進(jìn)一步具體為將菌體用裂解緩沖液重懸，用高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)菌液進(jìn)行破碎，用超高速離心機(jī)對(duì)破碎后的菌液進(jìn)行高速離心。
8.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第五步進(jìn)一步具體為取離心后的上清利用Ni2+親和層析柱在AKTA?Purifier蛋白純化系統(tǒng)上對(duì)上清蛋白進(jìn)行純化。
9.采用權(quán)利要求1至8任一種方法純化的免疫檢查點(diǎn)蛋白B7-H3亞型2Ig-B7-H3和4Ig-B7-H3。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方法，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第一步中優(yōu)化的4ig-b7-h3由金斯瑞生物公司取4ig-b7-h3的胞外結(jié)構(gòu)域合成并經(jīng)過了密碼子優(yōu)化以便增加蛋白在原核表達(dá)體系的表達(dá)量及溶解性。
3.如權(quán)利要求2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述密碼子優(yōu)化后的4ig-b7-h3的胞外結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如seq?id?no.1所示：
4.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第二步的宿主細(xì)胞為e.coli?rosseta(de3)。
5.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方法，其特征在于：所述第三步中采用iptg異丙基-β-d-硫代半乳糖苷進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
6.如權(quán)利要求1或2所述免疫檢查點(diǎn)蛋白b7-h3的表達(dá)純化方...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃嘉敏，李楠，廖舒捷，李雪飛，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。