【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體而言，涉及一種高通量篩選核酸適配體的方法。
技術介紹
1、核酸適配體(aptamer)是指通過指數富集的配體系統進化技術(selex)篩選分離得到的dna或者rna分子，具有特定和復雜的三維形狀，其特征是莖、環、凸起、發夾、假結、三倍體或四倍體。基于其三維結構，這些分子可以以高親和力和特異性與多種靶分子結合，如蛋白質、肽、核苷酸、抗生素、毒素和小分子。從單個分子到復雜的目標混合物或整個生物體。適配體與靶標的結合是由于結構相容性、芳香環的堆疊、靜電和范德華相互作用以及氫鍵作用，或這些效應的組合。與傳統抗體相比，核酸適體具有體積小、穩定性高、易化學修飾、低免疫性、高親和性、高特異性等優點，因此在生物成像，環境監測，臨床診斷，新藥合成等方面展示廣闊的前景。
2、隨著生物技術的發展，尤其是高通量測序技術的進步，為核酸適配體篩選提供了新的手段。借助高通量測序技術，我們可以獲得篩選過程中得到的每一輪次級文庫的序列信息，快速評估序列富集程度；同時，高通量測序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學信息，而且使得測序的費用和時間大大縮短。高通量測序技術結合高通量篩選技術，不僅可以快速獲得適配體，而且通過對篩選過程中產生的數據進行深入分析，進一步了解適配體的識別機制和作用機理。
3、目前以蛋白質大分子為靶標的核酸適配體篩選方法應用前景廣泛，但由于在篩選進程中有其他介質的干擾，篩選過程復雜，一般需要若干輪篩選；并且，目前篩選方法通量都較低，無法滿足高通量核酸適配體篩選的需求；同時，篩
4、因此，開發一種高通量篩選核酸適配體的方法，兼顧核酸適配體的親和力和特異性，將為今后的超高通量篩選，以及高通量鑒定提供解決方案，具有重要意義。
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種高通量篩選核酸適配體的方法。用于以蛋白為靶標，經隨機單鏈dna文庫篩選后，利用高通量測序手段經測序數據分析和處理后獲得具有優良特異性的適配體。通過本專利技術的方法，可以有效獲得具有高親和力和高特異性的適配體，將為高通量篩選，以及高通量鑒定提供解決方案，應用前景廣闊。
2、一方面，本專利技術提供了一種高通量篩選核酸適配體的方法，所述方法從富集文庫篩選核酸適配體時，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選；所述靶標蛋白的數量為至少2個；
3、從親和力方面篩選的方法為：挑選與靶標蛋白結合豐度高的核酸適配體；
4、從特異性方面篩選的方法為：挑選與靶標蛋白結合豐度高，與其他蛋白結合豐度低的核酸適配體。
5、本專利技術所述的豐度是指核酸適體與靶標蛋白結合的次數。
6、現有技術在篩選核酸適配體時，選取一個蛋白，將該蛋白與各核酸適配體結合的數量按照降序排列，按照結合次數降序依次選取核酸適配體，這樣會導致：(1)與該蛋白結合次數較低的核酸適配體無法被選擇，即使具有很好的特異性；(2)選取的高結合次數的核酸適配體可能特異性差，該核酸適配體與其他蛋白的結合次數可能大于與對應蛋白的結合次數。
7、本專利技術的高通量篩選方法，改進了篩選方式，從親和力和特異性兩方面進行挑選，與一種蛋白結合次數較低的核酸適配體仍能夠被挑選，避免了對具有高特異性、高親和力的適配體的遺漏；由于考慮到了一條核酸適配體與多種蛋白的結合，因此能夠避免篩選到特異性差的適配體；因此本專利技術的高通量篩選方法解決了現有技術篩選的弊端。
8、進一步的，包括以下步驟：
9、(1)進行一次篩選，高通量測序，建立次級文庫；所述一次篩選為selex篩選；
10、(2)針對次級文庫，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面篩選核酸適配體。
11、進一步的，步驟(2)為：針對次級文庫，進行二次篩選，高通量測序，建立三級文庫；所述二次篩選為selex篩選；將三級文庫與次級文庫進行匹配，刪除出錯序列，作為目標文庫，從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面篩選核酸適配體。
12、所述目標文庫用于縮小富集文庫的庫容量，可以著重從目標文庫篩選核酸適配體。
13、本專利技術中提及的一次篩選、二次篩選是對篩選階段的劃分，具體地，一次篩選、二次篩選通常包括多輪篩選，輪的意思是在一輪篩選結束后，將該輪篩選中所得文庫投入下一輪篩選中，多輪篩選組成一次篩選、二次篩選。
14、本專利技術中提及的文庫，包括初始文庫、次級文庫、三級文庫以及各輪篩選中所得文庫；(1)初始文庫為初始的隨機單鏈dna文庫，(2)次級文庫為通過一次篩選，富集得到的單鏈dna文庫，(3)三級文庫為通過二次篩選，富集得到的單鏈dna文庫，(4)各輪篩選中所得文庫，為在一次篩選或二次篩選中的各輪篩選結束得到的單鏈dna文庫。
15、通過對常規一次篩選后的富集文庫進行高通量測序，可以獲得大量的序列數據。進一步地，通過挑選出高豐度序列合成作為次級文庫，相對于初始文庫(包含1×1014～15個分子)來說，一是減小了庫容(包含3000個分子)，增加了文庫與靶標充分結合的機會；二是該次級文庫中每種序列都是均一的，保證了文庫與靶標之間均等結合的機會；同時，該次級文庫經過富集后所包含的潛在核酸適配體更多；這樣可以保證篩選出的核酸適配體具有更高的特異性和親和力。
16、通過將常規一次篩選后富集文庫或二次篩選后的富集文庫，使用ngs進行測序，可以獲得每條序列在每個蛋白中的占比情況。這樣可以更準確地評估適配體的特異性和親和力
17、進一步的，所述同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選的方法通過歸一化計算相對豐度獲得。
18、進一步的，所述歸一化計算為：
19、
20、r(a，a)是蛋白a與核酸適配體a結合的次數，cp(a)是蛋白a結合全部核酸適配體的總次數，n代表任意蛋白。
21、通過上述歸一化計算能夠得到各核酸適配體和各蛋白的相對豐度的矩陣，在矩陣中對各蛋白尋找相對豐度高的核酸適配體，該核酸適配體一定滿足親和力高、特異性強。
22、在一種方式中，所述歸一化計算為：
23、以cpmax為統一讀數，設定每個蛋白讀取核酸適配體總次數為cpmax，則歸一化處理后單個蛋白讀取核酸適配體總次數與cpmax之間的系數單條序列在單個蛋白讀取的總次數為：r×y；由此處理后得到序列總條數×蛋白靶標數的矩陣數據，核酸適配體為行，靶標為列，對每行進行最大值的標注，再以列挑選每個蛋白下最大值標注的高豐度序列。
24、通過上述歸一化計算能夠得到歸一化結合次數的矩陣數據，這一矩陣在橫向和縱向上表示親和力和特異性，可以從中選取親和力高、特異性強的核酸適配體。
25、上述兩種歸一化計算，分別得到相對豐度的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高通量篩選核酸適配體的方法，其特征在于，從富集文庫篩選核酸適配體時，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選；
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)為：針對次級文庫，進行二次篩選，高通量測序，建立三級文庫；將三級文庫與次級文庫進行匹配，刪除出錯序列，作為目標文庫，從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面篩選核酸適配體。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選的方法通過歸一化計算相對豐度獲得。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述歸一化計算公式為：
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述一次篩選包括多輪篩選，所述多輪篩選的次數根據Cq值確定，當Cq值較前一輪篩選降低時，一次篩選結束，次級文庫富集成功。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次篩選、二次篩選為SELEX篩選。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，
9.一種同時檢測核酸適配體的親和力和特異性的方法，其特征在于，核酸適配體的親和力和特異性通過歸一化計算相對豐度獲得，所述歸一化計算公式為：
10.一種用于高通量篩選核酸適配體的系統，其特征在于，所述系統包括富集文庫、數據分析模塊；所述數據分析模塊從富集文庫篩選核酸適配體，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選；
11.如權利要求10所述的系統，其特征在于，所述數據分析模塊通過將核酸適配體與靶標蛋白的結合次數進行歸一化計算，同時獲得核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性數據；所述數據分析模塊的歸一化計算的計算公式為：
12.如權利要求11所述的系統，其特征在于，所述系統還包括數據存儲模塊、數據采集模塊和數據輸出模塊；所述數據存儲模塊用于存儲富集文庫中核酸適配體與靶標蛋白結合次數；數據采集模塊用于采集富集文庫中核酸適配體與靶標蛋白結合次數的數據，數據輸出模塊用于輸出核酸適配體篩選結果。
13.一種結合蛋白的核酸適配體，其特征在于，蛋白SIX2的核酸適配體具有如SEQ?IDNO.6或SEQ?ID?NO.7所示的核苷酸序列；或蛋白RFWD3的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.8或SEQ?ID?NO.9所示的核苷酸序列；或蛋白HOXD11的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.10或SEQID?NO.11所示的核苷酸序列；或蛋白RBM10的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.12或SEQ?IDNO.13所示的核苷酸序列；或蛋白TAGAP的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.14或SEQ?ID?NO.15所示的核苷酸序列；或蛋白HNRNPCL1的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.16或SEQ?ID?NO.17所示的核苷酸序列；或蛋白ADARB1的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.18或SEQ?ID?NO.19所示的核苷酸序列；或蛋白TAF13蛋白的核酸適配體具有如SEQ?ID?NO.20或SEQ?ID?NO.21所示的核苷酸序列。
...【技術特征摘要】
1.一種高通量篩選核酸適配體的方法，其特征在于，從富集文庫篩選核酸適配體時，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選；
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)為：針對次級文庫，進行二次篩選，高通量測序，建立三級文庫；將三級文庫與次級文庫進行匹配，刪除出錯序列，作為目標文庫，從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面篩選核酸適配體。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩選的方法通過歸一化計算相對豐度獲得。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述歸一化計算公式為：
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述一次篩選包括多輪篩選，所述多輪篩選的次數根據cq值確定，當cq值較前一輪篩選降低時，一次篩選結束，次級文庫富集成功。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次篩選、二次篩選為selex篩選。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，次級文庫的制備包含兩條技術路線：
9.一種同時檢測核酸適配體的親和力和特異性的方法，其特征在于，核酸適配體的親和力和特異性通過歸一化計算相對豐度獲得，所述歸一化計算公式為：
10.一種用于高通量篩選核酸適配體的系統，其特征在于，所述系統包括富集文庫、數據分析模塊；所述數據分析模塊從富集文庫篩選核酸適配體，同時從核酸適配體與靶標蛋白的親和力和特異性兩方面進行篩...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚蔚泓，呂少康，羅昭鋒，刁寒，徐晶，吳金夢，張崢，張翔，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
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