【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于空間多組學分析，具體地，涉及一種用于空間多組學測序的建庫試劑盒及建庫方法。
技術介紹
1、單細胞組學以前所未有的分辨率研究腫瘤及微環境免疫細胞間復雜的互作關系。單細胞測序技術的發展，為我們揭示了乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等疾病中腫瘤微環境內免疫細胞浸潤程度與預后強相關。然而在生命體中，細胞并非孤立地起作用，而是受空間位置和微環境強烈影響。空間特征是決定細胞功能和命運的關鍵因素，對研究細胞在腫瘤微環境中特性和功能至關重要。然而，常規單細胞組學的研究會丟失單細胞定位的空間背景信息。
2、然而，目前還沒有利用單細胞空間轉錄組、微生物組、表觀組等多組學技術描繪腫瘤微環境中免疫細胞的互作機制，不利于腫瘤的精準治療。
技術實現思路
1、為了解決上述技術問題中的至少一個，本專利技術采用的技術方案如下：
2、本專利技術第一方面提供一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，所述建庫試劑盒包括：
3、帶有雙鏈序列的tn5轉座酶復合物，所述雙鏈序列分別為第一鏈序列和第二鏈序列，其中第一鏈序列5'-3'依次包括連接序列1和核心包埋序列，第二鏈序列5'-3'依次包括所述核心包埋序列的互補序列和tn5接頭序列，用于在切割基因組的同時將所述連接序列1和所述tn5接頭序列連接至目標dna片段上，其中，所述tn5接頭序列包括測序接頭2的一部分的互補序列，用于后續在所述目標dna上添加測序接頭1序列；
4、帶有鏈霉親和素標記的捕獲引物，依次包括用于捕獲目標
5、第一連接反應引物，依次包括至少一部分連接序列1的互補序列、第一分子標簽序列和連接序列2，用于基于所述至少一部分連接序列1的互補序列與所述連接序列1的雜交添加所述第一分子標簽序列；
6、第二連接反應引物，依次包括至少一部分連接序列2的互補序列、第二分子標簽序列和pcr引物序列，用于基于所述至少一部分連接序列2的互補序列與所述連接序列2的雜交添加所述第二分子標簽序列，其中，所述pcr引物序列包括測序接頭1的一部分的互補序列，用于后續在所述目標dna和所述目標片段上添加測序接頭1；
7、datp和末端轉移酶，用于利用所述末端轉移酶在所述目標片段上添加多聚a序列；
8、模板鏈置換反應引物，依次包括通用序列和多聚t序列，用于基于所述多聚t序列和所述多聚a序列的雜交添加所述通用序列，所述通用序列用于后續鏈置換反應產物的pcr擴增。
9、表觀組測序方法包括atac測序和cut&tag測序。上述利用所述帶有雙鏈序列的tn5轉座酶復合物進行轉座酶酶切是atac測序方法。在本專利技術的一些實施方案中，還可以使用cut&tag測序，此時所述帶有雙鏈序列的tn5轉座酶復合物利用以下試劑進行替換：
10、一抗工作液，含有能夠與目標蛋白特異性結合的一抗；
11、二抗工作液，含有能夠與所述一抗特異性結合的二抗；
12、帶有所述雙鏈序列的鏈球菌蛋白g偶聯tn5轉座酶復合物，用于基于所述鏈球菌蛋白g和所述二抗的結合錨定并切割所述目標蛋白附近的dna，并在切割dna的同時將所述連接序列1和所述tn5接頭序列連接在獲得的dna片段上。
13、在本專利技術的一些實施方案中，所述tn5轉座酶復合物或鏈球菌蛋白g偶聯tn5轉座酶復合物的制備方法如下：
14、(1)準備或獲得所述包括所述核心包埋序列的引物1、包括所述tn5接頭序列及所述核心包埋序列的互補序列的引物2和包括所述連接序列1及所述核心包埋序列的互補序列的引物3，將引物1分別與引物2和引物3按等比例混合后從95℃降65℃保持3～8min，再降至4℃獲得兩種轉座酶引物工作液；
15、(2)將tn5轉座酶或鏈球菌蛋白g偶聯tn5轉座酶與兩種轉座酶引物工作液于30℃孵育30～60min，得到所述tn5轉座酶復合物或鏈球菌蛋白g偶聯tn5轉座酶復合物。
16、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述引物1、引物2和引物3的序列分別如下：
17、引物1：5′-/5phos/ctgtctcttatacacatct-3′
18、引物2：5′-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3'
19、引物3：5′-/5phos/catcggcgtacgactagatgtgtataagagacag-3′
20、在本專利技術的一些優選實施方案中，具體制備方法如下：
21、(1)制備退火緩沖液：40mm?tris-hcl(ph?8.0)，50mm?nacl；將引物1、引物2和引物3干粉高速離心后，用退火緩沖液溶解至100μm。
22、(2)將引物1和引物2等體積混勻、引物1和引物3等體積混勻，在pcr儀中運行以下程序：95℃5min，按-0.1℃/sec逐步冷卻至65℃，65℃5min，按-0.1℃/sec逐步冷卻至4℃，完成轉座酶接頭1和轉座酶接頭2的制備，制備的轉座酶接頭1和轉座酶接頭2濃度為50μm。
23、(3)在ep管中將5μl的轉座酶接頭1(50μm)和5μl的轉座酶接頭2(50μm)吹打混勻得到接頭混合物。向接頭混合物的ep管中加入500pm的tn5裸酶或鏈球菌蛋白g偶聯tn5裸酶，輕輕吹打混勻，在23℃的溫度下孵育30min。
24、在本專利技術的一些實施方案中，所述測序接頭1和測序接頭2為常規的雙末端測序用接頭，例如illumina接頭。優選地為p7接頭和p5接頭，其中任一接頭可包括index(或稱brocode)序列。
25、在本專利技術的一些實施方案中，所述目標蛋白選自修飾的組蛋白、轉錄因子、dna修復蛋白和dna甲基化蛋白中的至少一種。在本專利技術的一些具體實施方案中，所述修飾的組蛋白是指選自h3k4me3、h3k4me1、h3k9ac、h3k9me3、h3k27ac、h3k27me3和h3k36me3中一種的修飾。
26、其中h3k4me3的功能為活化，位于啟動子；h3k4me1的功能為活化，位于增強子；h3k9ac的功能為活化，位于增強子、啟動子；h3k9me3的功能為阻遏，位于衛星重復序列、端粒、近著絲粒區；h3k27ac的功能為活化，位于增強子、啟動子；h3k27me3的功能為阻遏，位于啟動子、基因富集區域；h3k36me3的功能為活化，位于基因體。
27、在本專利技術的一些實施方案中，所述目標序列和所述捕獲序列選自以下情形之一：
28、(1)所述目標序列為組織樣本中rna序列和微生物中dna和rna序列，所述捕獲序列為隨機序列，此種情形下后續可以同時構建轉錄組測序文庫和微生物組測序文庫；
29、(2)所述目標序列為微生物保守區域序列，所述捕獲序列為特異性結合所述保守區域序列的引物序列，此種情形下后續可以構建微生物組測序文庫本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述建庫試劑盒包括：
2.根據權利要求1所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述Tn5轉座酶復合物利用以下試劑進行替換：
3.根據權利要求1或2所述的一種用于組織空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述Tn5轉座酶復合物或鏈球菌蛋白G偶聯Tn5轉座酶復合物的制備方法如下：
4.根據權利要求2所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述目標蛋白選自修飾的組蛋白、轉錄因子、DNA修復蛋白和DNA甲基化蛋白中的至少一種。
5.根據權利要求3所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述修飾的組蛋白是指選自H3K4me3、H3K4me1、H3K9ac、H3K9me3、H3K27ac、H3K27me3和H3K36me3中一種的修飾。
6.根據權利要求1～5任一所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述目標序列和所述捕獲序列選自以下情形之一：
7.根據權利要求1～5任
8.一種利用權利要求1或2所述的建庫進行盒進行組織樣本空間多組學測序的建庫方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據權利要求8所述的建庫方法，其特征在于，所述第一逆轉錄反應條件為8℃到50℃的多重退火梯度循環。
10.根據權利要求9所述的建庫方法，其特征在于，所述第一逆轉錄反應條件為8℃12sec，15℃45sec，20℃45sec，30℃30sec，42℃2min，10～12個循環；42℃45min。
...【技術特征摘要】
1.一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述建庫試劑盒包括：
2.根據權利要求1所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述tn5轉座酶復合物利用以下試劑進行替換：
3.根據權利要求1或2所述的一種用于組織空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述tn5轉座酶復合物或鏈球菌蛋白g偶聯tn5轉座酶復合物的制備方法如下：
4.根據權利要求2所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述目標蛋白選自修飾的組蛋白、轉錄因子、dna修復蛋白和dna甲基化蛋白中的至少一種。
5.根據權利要求3所述的一種用于組織樣本空間多組學測序的建庫試劑盒，其特征在于，所述修飾的組蛋白是指選自h3k4me3、h3k4me1、h3k9ac、h3k9me3、h3k27ac、h3k27me3和h...
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。