【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及保種蜜蜂非遺傳圖譜85個strs位點的pcr質(zhì)量控制及pcr擴(kuò)增子制備方法。
技術(shù)介紹
1、西方蜜蜂(apis?mellifera)，簡稱蜜蜂，在發(fā)達(dá)國家畜牧經(jīng)濟(jì)的種畜貢獻(xiàn)率排序中處于第三位，次于牛和豬而高于雞；1993年，蜜蜂非遺傳圖譜2個strs位點的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物作為一種蜜蜂輔助育種dna標(biāo)記，首次應(yīng)用于蜜蜂系譜關(guān)系鑒定等蜜蜂育種計劃研究[1]；之后，蜜蜂strs標(biāo)記類似于人等其他物種dna標(biāo)記作為主要技術(shù)手段，充當(dāng)鑒定保種蜜蜂種內(nèi)多樣性的dna標(biāo)記金標(biāo)準(zhǔn)。在蜜蜂最新strs遺傳圖譜(或蜜蜂全基因組序列圖譜)公布之前，相關(guān)研究主要依賴于蜜蜂非遺傳圖譜85個strs位點的等位基因多態(tài)性。然而，它們總體上在使用過程中存在2個方面的技術(shù)缺陷：第一，strs位點的pcr引物物理身份不明確，如，pcr引物有混淆的名稱、錯誤的序列和未知的染色體定位；第二，strs位點的pcr擴(kuò)增方法不合理，如，pcr體系有可疑、未知乃至錯誤的組分構(gòu)成以及不規(guī)范的pcr熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置。由此，pcr擴(kuò)增strs等位基因受多重因素影響，沒有經(jīng)過pcr技術(shù)的質(zhì)量控制，pcr重復(fù)性差，pcr擴(kuò)增子得不到優(yōu)勢擴(kuò)增，以至于這些strs位點沒有被廣泛應(yīng)用于蜜蜂保種工作。此外，pcr擴(kuò)增子分離水平不夠高，例如，使用低分辨的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠分離pcr產(chǎn)物。
2、參考文獻(xiàn)
3、[1]haberl?m,tautz?d.tri-and?tetranucleotide?microsatellite?loci?inho
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是如何通過pcr質(zhì)量控制開發(fā)高特異性和高穩(wěn)定性的pcr擴(kuò)增引物，建立pcr擴(kuò)增子優(yōu)勢擴(kuò)增的pcr質(zhì)量控制操作標(biāo)準(zhǔn)，提高保種蜜蜂strs位點的利用率。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)首先提供了制備檢測蜜蜂非遺傳圖譜strs位點的pcr擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品的方法，所述pcr擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品可包括85種pcr產(chǎn)物，所述方法可包括以蜜蜂(apis?mellifera)的基因組dna為模板，分別使用(檢測蜜蜂非遺傳圖譜85個strs位點的)85對引物對進(jìn)行85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)獲得(優(yōu)勢擴(kuò)增和穩(wěn)定擴(kuò)增)所述85種pcr產(chǎn)物的步驟；
3、上述方法中，所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)的體系的總體積可為：所述85組的第1-第52組及第54-第85組pcr的反應(yīng)體系總體積可為10μl，第53組的反應(yīng)體系總體積可為25μl；
4、上述方法中，所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)的體系中所述模板含量可為：所述85組的第1-14組、第48-50組、第51-52組、第58-69組和第71-82組的所述模板含量可為25ng，第15-47組、第54-57組和第70組的所述模板含量可為5-10ng，第53組的所述模板含量為15-25ng，第83-85組的所述dna模板含量可為5ng；
5、上述方法中，所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系中dntp的終濃度可為：所述85組的第1-14組的dntp可濃度為0.2mmol/l，第15-21組、第51-57組、第70組和第73組的dntp濃度可為0.075mmol/l，第22-47組的dntp濃度可為0.06mmol/l，第48-50組的dntp濃度可為0.02mmol/l，第58-69組、第71-72組和第74-85組dntp濃度可為0.25mmol/l；
6、上述方法中，所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系中mgci2終濃度為：所述85組的第1-14組的mgci2濃度可為1.5mmol/l，第15-21組第48-50組和第70組的mgci2濃度可為1.2-1.5mmol/l，第22-47組的mgci2濃度可為1-2.5mmol/l，第51-52組的mgci2濃度可為1-1.2mmol/l，第53組的mgci2濃度可為1.7mmol/l，第54-57組和第73組的mgci2濃度可為1.2-1.7mmol/l，第58-69組和第74-85組的mgci2濃度可為2.5mmol/l，第71-72組的mgci2濃度可為1.2mmol/l；
7、上述方法中，所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)對應(yīng)的所述85對引物對的核苷酸序列可為如下：
8、a1)第1對引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna組成；
9、a2)第2對引物對由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈dna組成；
10、a3)第3對引物對由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈dna組成；
11、a4)第4對引物對由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈dna組成；
12、a5)第5對引物對由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈dna組成；
13、a6)第6對引物對由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈dna組成；
14、a7)第7對引物對由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈dna組成；
15、a8)第8對引物對由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈dna組成；
16、a9)第9對引物對由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈dna組成；
17、a10)第10對引物對由序列表中序列19和序列20所示的兩條單鏈dna組成；
18、a11)第11對引物對由序列表中序列21和序列22所示的兩條單鏈dna組成；
19、a12)第12對引物對由序列表中序列23和序列24所示的兩條單鏈dna組成；
20、a13)第13對引物對由序列表中序列25和序列26所示的兩條單鏈dna組成；
21、a14)第14對引物對由序列表中序列27和序列28所示的兩條單鏈dna組成；
22、a15)第15對引物對由序列表中序列29和序列30所示的兩條單鏈dna組成；
23、a16)第16對引物對由序列表中序列31和序列32所示的兩條單鏈dna組成；
24、a17)第17對引物對由序列表中序列33和序列34所示的兩條單鏈dna組成；
25、a18)第18對引物對由序列表中序列35和序列36所示的兩條單鏈dna組成；
26、a19)第19對引物對由序列表中序列37和序列38所示的兩條單鏈dna組成；
27、a20)第20對引物對由序列表中序列39和序列40所示的兩條單鏈dna組成；
28、a21)第21對引物對由序列表中序列41和序列42所示的兩條單鏈dna組成；
29、a22)第22對引物對由序列表中序列43和序列44所示的兩條單鏈dna組成；
30、a23)第23對引物對由序列表中序列45和序列46所示的兩條單鏈dna組成；...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.制備檢測蜜蜂非遺傳圖譜STRs位點的PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品包括85種PCR產(chǎn)物，所述方法包括以蜜蜂(Apis?mellifera)的基因組DNA為模板，分別使用85對引物對進(jìn)行85組PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得所述85種PCR產(chǎn)物的步驟；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述85組PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體系中所述模板含量為：第15-47組、第54-57組和第70組的所述模版含量為7.5ng，第53組的所述模版含量為20ng；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述85組PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件包括變性、退火和延伸循環(huán)數(shù)的設(shè)定，所述延伸循環(huán)數(shù)的設(shè)定為：所述85組的第1-14組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25，第15-21組和第70組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25-30，第22-50組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25-30，第15-21組和第70組的所述延伸循環(huán)數(shù)為30-35，第51-57組和第74-82組的所述延伸循環(huán)數(shù)為30，第58-69組、第71-73組和第83-85組的所述延伸循環(huán)數(shù)為35；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于：
6.檢測或輔助檢測蜜蜂非遺傳圖譜85個STRs位點多態(tài)性的方法，其特征在于：所述方法使用權(quán)利要求1中所述的85對引物對和權(quán)利要求1-5中任意權(quán)利要求所述的方法對8個隨機(jī)的待測蜜蜂基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得所述待測蜜蜂非遺傳圖譜85個STRs位點中每個所述STRs位點的8個PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物，根據(jù)每個所述STRs位點的所述8個PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物獲得待測蜜蜂非遺傳圖譜85個STRs位點的多態(tài)性。
7.鑒定或輔助鑒定蜜蜂系譜關(guān)系的方法，其特征在于：所述方法使用權(quán)利要求1中所述的85對引物對和權(quán)利要求1-5中任意權(quán)利要求所述的方法對8個隨機(jī)的待鑒定蜜蜂譜系基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得所述待鑒定蜜蜂譜系非遺傳圖譜85個STRs位點中每個所述STRs位點的8個PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物，根據(jù)每個所述STRs位點的所述8個PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物獲得待鑒定蜜蜂譜系非遺傳圖譜85個STRs位點的多態(tài)性；根據(jù)所述非遺傳圖譜85個STRs位點的多態(tài)性獲得所述待鑒定蜜蜂系譜的關(guān)系。
8.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求中所述的85種PCR產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的85種PCR產(chǎn)物的下述任一種應(yīng)用：
10.權(quán)利要求6或7所述方法的下述任一種應(yīng)用：
...【技術(shù)特征摘要】
1.制備檢測蜜蜂非遺傳圖譜strs位點的pcr擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品的方法，其特征在于：所述pcr擴(kuò)增子標(biāo)準(zhǔn)品包括85種pcr產(chǎn)物，所述方法包括以蜜蜂(apis?mellifera)的基因組dna為模板，分別使用85對引物對進(jìn)行85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)獲得所述85種pcr產(chǎn)物的步驟；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)的體系中所述模板含量為：第15-47組、第54-57組和第70組的所述模版含量為7.5ng，第53組的所述模版含量為20ng；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述85組pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件包括變性、退火和延伸循環(huán)數(shù)的設(shè)定，所述延伸循環(huán)數(shù)的設(shè)定為：所述85組的第1-14組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25，第15-21組和第70組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25-30，第22-50組的所述延伸循環(huán)數(shù)為25-30，第15-21組和第70組的所述延伸循環(huán)數(shù)為30-35，第51-57組和第74-82組的所述延伸循環(huán)數(shù)為30，第58-69組、第71-73組和第83-85組的所述延伸循環(huán)數(shù)為35；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于：
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于：<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李興安，牛慶生，劉楠楠，常志光，薛美鳳，
申請(專利權(quán))人：吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所吉林省蜂產(chǎn)品質(zhì)量管理監(jiān)督站，吉林省蜜蜂遺傳資源基因保護(hù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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