【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于酶工程，涉及一種纖維二糖差向異構酶突變體及其應用。
技術介紹
1、乳果糖(lactulose)，別名乳酮糖、異構化乳糖、4-o-β-d-吡喃半乳糖基-d-果糖等，是d-半乳糖和d-果糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖，其成品為黃色澄明液體，甜度相當于乳糖，是蔗糖的48％-60％，口感好，粘度低，熱量低，安全性高，不易發生美拉德反應。乳果糖具有治療慢性便秘和肝性腦病的功效，例如每天攝入10-40g就可以緩解便秘。復旦大學附屬華東醫院報道乳果糖口服液對老年便秘患者的有效率達79.2％，療效顯著。乳果糖還是一種益生元，可增值雙歧桿菌的活性，如含0.5％乳果糖的配方奶粉能夠刺激嬰兒腸道內雙歧桿菌的生長，乳果糖也不會對配方奶粉的品質造成影響。2011年，乳果糖被歐盟飼料和食品質量安全管理局(quality?and?safety?of?feeds?and?food?for?europe；european?commission?2011)認定為一種新型飼料添加劑。它可以通過促進益生菌的生長來抑制有害菌的繁殖，從而提高畜禽對腸道疾病的免疫力。因此，乳果糖在醫藥行業、食品和動物飼料領域都得到了廣泛應用。
2、商業化的乳果糖主要由化學法合成，需要使用大量的化學物質，產生較多的副產物，導致分離純化步驟復雜，環境污染大。而酶法催化乳糖生產乳果糖，反應條件則比較溫和，符合低碳經濟和綠色環保的要求。目前，酶法催化生產乳果糖的酶主要有糖苷水解酶(glycosidehydrolase,ec3.2.1)和纖維二糖差向異構酶(cello
3、kim等在2012-2013年的研究中提到，采用來源于caldicellulosiruptorsaccharolyticus的纖維二糖差向異構酶(csce)，在ph?7.5、80℃，700g/l乳糖的條件下，催化乳糖產生乳果糖的最大產量為408g/l，轉化率為58％，副產物依匹乳糖的含量為15％(kim?ys,dk?o.lactulose?production?from?lactose?as?a?single?substrate?by?athermostable?cellobiose?2-epimerase?from?caldicellulosiruptor?saccharolyticus[j].bioresour?technol.2012,104:668-672)；后來又在反應體系中加入硼酸鹽(硼酸鹽:乳糖的摩爾比＝1:1)，乳果糖的產量提高至616g/l，轉化率提高至88％，該方法中盡管乳果糖的轉化率提高了，但使用了大量硼酸鹽，后續的分離純化很難將其除盡，增加了乳果糖的生產成本(kim?ys,kim?je,dk?o.borate?enhances?the?production?of?lactulose?fromlactose?by?cellobiose?2-epimerase?from?caldicellulosiruptor?saccharolyticus[j].bioresource?technology.2013,128:809-812)。授權專利cn114317509b報道了caldicellulosiruptor?saccharolyticus來源的csce雙突變體f231c/s173c，異構活力提高到原來的287％，但乳果糖的轉化率僅有21.545％，副產物依匹乳糖含量為18.405％。上述針對caldicellulosiruptor?saccharolyticus來源的csce的研究報道，都是通過異源表達或突變改造來提高酶的活力和轉化率，雖有提升，但還是偏低，造成乳果糖的生產成本偏高，限制了工業化生產應用。
4、為解決酶法生產乳果糖的高成本問題，我們以caldicellulosiruptorsaccharolyticus來源的纖維二糖差向異構酶csce為出發點，通過構建突變體文庫和定向篩選，獲得了一系列的高活力和高轉化率的突變體酶，為推進酶法生產乳果糖的工業化應用奠定了基礎。
技術實現思路
1、本專利技術的首要目的是提供纖維二糖差向異構酶突變體，相比較野生型csce具有更高的催化活力，并在以乳糖為原料催化制備乳果糖時，具有更高的轉化收率。
2、為實現此目的，在基礎的實施方案中，本專利技術提供一種纖維二糖差向異構酶突變體，所述的突變體在seq?id?no.1所示氨基酸序列的纖維二糖差向異構酶csce中突變多個氨基酸位點，突變的氨基酸位點包括g104s、y156a和l255g中的一個或多個。
3、進一步地，突變方式包括以下7種中的任一種：g104s；y156a；l255g；g104s/y156a；g104s/l255g；y156a/l255g；g104s/y156a/l255g。
4、優選：g104s/y156a；g104s/l255g；y156a/l255g；g104s/y156a/l255g中的任一種。
5、更進一步地：突變方式包括以下3種中的任一種：g104s/y156a；y156a/l255g；g104s/y156a/l255g。
6、更進一步地：突變方式包括以下2種中的任一種：y156a/l255g；g104s/y156a/l255g。
7、本專利技術第二個目的是提供編碼上述的纖維二糖差向異構酶突變體的多核苷酸，以能夠使編碼的纖維二糖差向異構酶突變體較野生型csce具有更高的催化活力和轉化收率。
8、本專利技術第三個目的是提供含有上述的纖維二糖差向異構酶突變體的多核苷酸的載體。
9、本專利技術第四個目的是提供含有上述載體的菌株。
10、本專利技術的第五個目的是提供一種酶法制備乳果糖的方法，以能夠更好的制備乳果糖產品。
11、為實現此目的，在基礎的實施方案中，本專利技術提供一種制備乳果糖的方法，所述的方法是在反應體系中，用前述的纖維二糖差向異構酶突變體，催化乳糖生產乳果糖。
12、在一種優選的實施方案中，本專利技術提供一種制備乳果糖的方法，其中所述反應溫度為50-80℃、ph7.0-8.0，乳糖濃度為400-700g/l，加酶量為10-30u/ml，攪拌速度為100-200r/min，反應時間1-5h。
13、本專利技術的有益效果在于，利用本專利技術的纖維二糖差向異構酶突變體制備乳果糖時，與突變之前的酶相比，具有更高的催化活力(最大提高約5倍)和轉化收率(最大提升約20％)，降低了生產成本，更適用于工業規模化生產應用。
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1.一種纖維二糖差向異構酶突變體，其特征在于：在SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列中進行突變，突變的氨基酸位點包括G104S、Y156A和L255G中的一個或多個。
2.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下7種中的任一種：G104S；Y156A；L255G；G104S/Y156A；G104S/L255G；Y156A/L255G；G104S/Y156A/L255G。
3.根據權利要求2所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下4種中的任一種：G104S/Y156A；G104S/L255G；Y156A/L255G；G104S/Y156A/L255G。
4.根據權利要求3所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下3種中的任一種：G104S/Y156A；Y156A/L255G；G104S/Y156A/L255G。
5.根據權利要求4所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下2種中的任一種：Y156A/L255G；G104S/Y156A/L255G。
6.一種編碼權利要求1-5任一項所述的纖維二糖差向異構酶
7.含有權利要求6所述的纖維二糖差向異構酶突變體的多核苷酸的載體。
8.含有權利要求7所述的載體的菌株。
9.一種纖維二糖差向異構酶突變體制備乳果糖的方法，其特征在于：以乳糖為原料，在權利要求1-5任一項纖維二糖差向異構酶突變體的作用下，催化生產乳果糖。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述反應參數為：反應溫度為50-80℃、pH7.0-8.0，乳糖濃度為400-700g/L，加酶量為10-30U/ml，攪拌速度為100-200r/min，反應時間1-5h。
...【技術特征摘要】
1.一種纖維二糖差向異構酶突變體，其特征在于：在seq?id?no.1所示的氨基酸序列中進行突變，突變的氨基酸位點包括g104s、y156a和l255g中的一個或多個。
2.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下7種中的任一種：g104s；y156a；l255g；g104s/y156a；g104s/l255g；y156a/l255g；g104s/y156a/l255g。
3.根據權利要求2所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下4種中的任一種：g104s/y156a；g104s/l255g；y156a/l255g；g104s/y156a/l255g。
4.根據權利要求3所述的突變體，其特征在于：突變方式包括以下3種中的任一種：g104s/y156a；y156a/l255g；g104s/y156a/l25...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙強，許崗，趙士敏，周晶輝，劉洋，張嬌，向潔，
申請(專利權)人：湖南寶利士生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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