【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于種植領域，具體涉及一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法。
技術介紹
1、大豆發根轉化是一種遺傳轉化技術，利用發狀根農桿菌的轉化侵染能力，將外源基因導入大豆的基因組中。這種轉化體系具有周期短、轉化效率高且不易產生變異等優點，因此在基因功能研究和品種改良等領域得到了廣泛應用。
2、且現有的大豆發根轉化方法流程為：
3、1、選取種皮完好、無病斑、無蟲害的大豆種子。
4、2、對大豆種子進行滅菌處理。
5、3、將滅菌后的大豆種子接種在發芽培養基中，在特定的溫度和光照條件下萌發。
6、4、制備侵染菌液。取原菌液，并侵染大豆的子葉節。
7、但是現有方法中，不能夠精準控制菌液內部含量，從而導致在后續侵染時，因菌種含量比例偏差過大，進而影響到大豆發根轉化的效果，為此本申請設計了一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，使得發根農桿菌可以精準的與大豆進行侵染轉化。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，具體包括如下操作步驟：
4、s1：種子挑選,挑選外表完好、飽滿、光滑、圓潤、無斑的大豆種子于培養皿中，噴灑75％的酒精清洗大豆種子，清洗后擦干多余酒精，再挑選一遍，之后放入無菌玻璃瓶中；
5、s2：種子滅菌,采
6、s3：種子萌發,滅菌后大豆種子放在無菌玻璃瓶中，加入無菌水淹沒大豆，加無菌水的量超過大豆兩倍，等種子完全吸脹后，棄多余無菌水，將種子放在原來瓶中萌發；
7、s4：農桿菌的活化,從-80℃冰箱中取出低溫保藏的農桿菌菌液，融化后用接種環蘸取少量的菌種在lb培養基上劃線，28℃培養2-3天，一個菌液涂4個板子可用于250個外植體的侵染；
8、s5：侵染液的制備，在無菌的50ml離心管中倒入40ml左右的lccm，用接種環將lb平板上的菌全部挑到管中，重懸菌液，測出od值，最后用液體lccm重懸沉淀使od650＝0.6～0.7；
9、s6：外植體的制備、侵染、共培養：
10、(1)外植體制備
11、萌發12h的種子，用手術刀在兩個子葉中間將胚軸縱向切開，同時去掉外植體的頂芽及側芽，并將下胚軸切除一部分，保留3-4mm，每顆種子可產生2個用于轉化的子葉節外植體；
12、(2)外植體的侵染
13、將子葉節外植體放在重懸的農桿菌菌液中，50ml侵染液可浸泡侵染100個外植體，放入25℃，侵染0.5～4hr，每隔10min搖晃一次，使外植體與菌液充分接觸；
14、(3)外植體共培養
15、侵染完成后小心倒掉多余的農桿菌菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液，在無菌培養皿上平鋪一層無菌濾紙，向濾紙中滴加1ml的lccm，浸染后的外植體平鋪于濾紙上，20℃，黑暗條件下共培養3d，光照條件下共培養1d使外植體變綠；
16、s7：毛狀根誘導，有傷口的一面朝上，下胚軸朝上斜插入rim培養基中，4-6個/皿，放入組培室中24℃、16/8光照培養10-14天。
17、作為優選，所述步驟3中無菌水淹沒大豆的浸泡時間為9～16h，所述步驟3中種子萌發溫度為25℃，萌發時間為12h。
18、作為優選，所述步驟4中lb培養基1l標配ph＝7主要成分為：
19、
20、作為優選，所述步驟6中lccm1l標配ph＝5.4主要成分為：
21、
22、作為優選，所述步驟7中rim培養基1l標配ph＝5.7主要成分為：
23、
24、本專利技術的技術效果和優點：
25、本申請通過在侵染前，從-80℃冰箱中取出低溫保藏的農桿菌菌液，融化后用接種環蘸取少量的菌種在lb培養基上劃線，28℃培養2-3天，一個菌液涂4個板子可用于250個外植體的侵染，隨后在無菌的50ml離心管中倒入40ml左右的lccm，用接種環將lb平板上的菌全部挑到管中，重懸菌液，測出od值，最后用液體lccm重懸沉淀使od650＝0.6～0.7，從而可以對菌液的質量進行精準控制，避免菌液內部菌種含量出現偏差，相對于現有的大豆發根轉化方法，本申請可以對發根農桿菌介導，進行控制并對菌液進行保存管理，以便于后續的使用；
26、通過對滅菌后的大豆種子進行萌發，手術刀在兩個子葉中間將胚軸縱向切開，同時去掉外植體的頂芽及側芽，并將下胚軸切除一部分，保留3-4mm，從而可以使得每顆種子可產生2個用于轉化的子葉節外植體，在確保轉化的情況下節省種子；
27、通過侵染完成后小心倒掉多余的農桿菌菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液，在無菌培養皿上平鋪一層無菌濾紙，向濾紙中滴加1ml的lccm，浸染后的外植體平鋪于濾紙上，黑暗條件下共培養3d，光照條件下共培養1d使外植體變綠，最后為了提高轉化效果，通過毛狀根誘導，使有傷口的一面朝上，下胚軸朝上斜插入rim培養基中，4-6個/皿，放入組培室中24℃、16/8光照培養10-14天。
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1.一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于，具體包括如下操作步驟：
2.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于：所述步驟3中無菌水淹沒大豆的浸泡時間為9～16h，所述步驟3中種子萌發溫度為25℃，萌發時間為12h。
3.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于：所述步驟4中LB培養基1L標配PH＝7主要成分為：
4.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于：所述步驟6中LCCM1L標配PH＝5.4主要成分為：
5.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于：所述步驟7中RIM培養基1L標配PH＝5.7主要成分為：
【技術特征摘要】
1.一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于，具體包括如下操作步驟：
2.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其特征在于：所述步驟3中無菌水淹沒大豆的浸泡時間為9～16h，所述步驟3中種子萌發溫度為25℃，萌發時間為12h。
3.根據權利要求1所述的一種發根農桿菌介導的大豆發根轉化方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：童飛，王幸，王好讓，李思夢，徐澤俊，齊玉軍，邢興華，晉彤彤，
申請(專利權)人：江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所江蘇徐州甘薯研究中心，
類型：發明
國別省市：
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