【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr引物及方法。
技術介紹
1、輪狀病毒（rotavirus，rvs）屬于輪狀病毒科輪狀病毒屬，呈十二面體對稱分布，三層殼體，無囊膜，基因組由11個節段雙股rna組成；具有6個編碼蛋白（vp1-vp4、vp6、vp7）以及6個非編碼蛋白（nsp1-nsp6）。根據輪狀病毒抗原關系和基因組rna節段的page電泳圖譜，分為7個種或血清型，即a～g。根據保護性抗原vp4和vp7的免疫原性和基因結構又可根據輪狀病毒血清群分為p基因型和g基因型。輪狀病毒是引起動物腹瀉的主要原因之一。輪狀病毒可以引起幼年動物腹瀉、嘔吐等嚴重的急性腸道傳染性疾病，而對于成年動物來說，輪狀病毒多數為隱性感染。豬輪狀病毒在仔豬中，引起腹瀉、營養不良等癥狀，嚴重時可以導致仔豬死亡，主要引起仔豬小腸病變、小腸絨毛縮短、微絨毛不規則等小腸的病理組織變化。對于牛而言，輪狀病毒可引起犢牛的酸中毒、反芻減弱、腹瀉、四肢無力，甚至可以引起消化道出血以及腸黏膜脫落，可造成牛場的巨大損失。d型輪狀病毒目前僅在禽類中發現，可導致禽類腹瀉等營養不良的情況，被認為是導致禽類ssr的主要原因之一。
2、穿山甲，鱗甲目穿山甲科穿山甲屬，屬于國家一級保護動物。但由于其甲片的藥用價值和多種原因的影響下，穿山甲數量不斷減少。此外，穿山甲孕期較長，且卵胎生，種群數量增長速度較慢。根據基因組的分析，穿山甲體內產生干擾素（inf）的基因甲基化，使其體內的干擾素合成受阻，對病原微生物抵抗力下降，導致穿山甲體內所攜帶的病原體種
3、目前對輪狀病毒的檢驗是通過對糞便的電鏡檢查以及病毒分離培養，這兩種方式是確認輪狀病毒感染的金標準，但這兩種方式存在耗時長、花費高等缺點，在臨床上一般比較少見。而在實驗室中，輪狀病毒的鑒定采用rt-pcr、elisa等特異性的方法對糞便進行檢測。目前，輪狀病毒的檢查僅針對于常見的家畜，如豬、牛、羊等動物，且大部分的檢測針對的毒株為a型輪狀病毒（rva），d型輪狀病毒（rvd）僅僅是對禽類進行設計，而針對穿山甲輪狀病毒的檢測方式也尚未發現。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為穿山甲rvd檢測提供了一種特異、敏感、快速、簡便、可定量檢測穿山甲rvd的熒光定量pcr引物及方法，是一種sybr?green染料法熒光定量方法，可快速特異地檢測rvd。
2、本專利技術的第一個目的是提供一種檢測穿山甲d型輪狀病毒（rotavirus?d）的熒光定量pcr引物，包括上游引物rvd-f和下游引物rvd-r，所述的上游引物rvd-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述的下游引物rvd-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
3、本專利技術的第二個目的提供是一種檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr試劑盒，包括所述的檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr引物和sybr?green染料法熒光定量pcr試劑。
4、優選，所述的試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品為含有穿山甲d型輪狀病毒的vp6基因片段的重組質粒，所述的陰性對照品為無酶ddh2o。
5、本專利技術的第三個目的是提供一種非疾病診斷目的的檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr方法，包括以下步驟：
6、s1.?提取待檢樣品的rna并反轉錄為cdna；
7、s2.?利用所述的試劑盒，以步驟s1獲得的cdna為模板進行熒光定量pcr擴增；
8、s3.?反應結束后，根據擴增曲線情況判斷待檢樣品中是否含有穿山甲d型輪狀病毒；所述的判斷的方法為：如果擴增曲線為典型熒光擴增曲線，則待檢樣品中含有穿山甲d型輪狀病毒；如果擴增曲線無典型熒光擴增曲線，則待檢樣品中不含有穿山甲d型輪狀病毒。
9、本專利技術的第四個目的是提供所述的檢測穿山甲d型輪狀病毒（rotavirus?d）的熒光定量pcr引物、所述的試劑盒在檢測穿山甲d型輪狀病毒中的應用。
10、本專利技術的有益效果：
11、本專利技術利用熒光rt-pcr反應的快速、靈敏及污染性小等特點，建立了熒光rt-pcr檢測方法，在穿山甲d型輪狀病毒檢測中發揮作用。本專利技術采用的是分子生物學檢測的方法，相比于其他檢測方式，分子生物學檢測是一種準確性強、靈敏度高的檢測方式，對于穿山甲輪狀病毒的檢測可信程度高，且具有操作簡單、靈敏等特點。
12、本專利技術的sybr?green染料法熒光定量pcr檢測試劑含有用于檢測rvd的兩對特異性引物。本專利技術的試劑盒檢測結果特異性好，可以對穿山甲rvd進行特異性的檢測，且擴增曲線良好，其他可感染穿山甲的相關病原均未出現特異性擴增曲線；敏感性高，檢測10倍梯度稀釋的陽性標準品，檢出限度為101copies/μl；檢測快速簡便，解決了現有rvd的檢測方法耗時費力、特異性敏感性差、成本高等的問題，對于確定穿山甲是否感染rvd具有重要意義。
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1.?一種檢測穿山甲D型輪狀病毒（Rotavirus?D）的熒光定量PCR引物，其特征在于，包括上游引物RVD-F和下游引物RVD-R，所述的上游引物RVD-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的下游引物RVD-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.?一種檢測穿山甲D型輪狀病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的檢測穿山甲D型輪狀病毒的熒光定量PCR引物和SYBR?Green染料法熒光定量PCR試劑。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品為含有穿山甲D型輪狀病毒的VP6基因片段的重組質粒，所述的陰性對照品為無酶ddH2O。
4.一種非疾病診斷目的的檢測穿山甲D型輪狀病毒的熒光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步驟：
5.?權利要求1所述的檢測穿山甲D型輪狀病毒（Rotavirus?D）的熒光定量PCR引物、權利要求2或3所述的試劑盒在檢測穿山甲D型輪狀病毒中的應用。
【技術特征摘要】
1.?一種檢測穿山甲d型輪狀病毒（rotavirus?d）的熒光定量pcr引物，其特征在于，包括上游引物rvd-f和下游引物rvd-r，所述的上游引物rvd-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述的下游引物rvd-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
2.?一種檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的檢測穿山甲d型輪狀病毒的熒光定量pcr引物和sybr?green染料法熒光定量pcr試劑。
...【專利技術屬性】
技術研發人員：華彥，劉莎莎，余界石，王凱，梁曉彤，陳子僑，
申請(專利權)人：廣東省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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