一種檢測赭曲霉毒素Ａ的試劑盒及其檢測方法技術

一種檢測赭曲霉毒素Ａ的試劑盒及其檢測方法，屬于光激化學發光免疫分析技術領域，用于對谷物，飼料及其制品中赭曲霉毒素Ａ（ＯＴＡ）含量的檢測。本發明專利技術試劑盒的基礎是均相標記免疫反應。取包被有ＯＴＡ－ＢＳＡ的發光微粒加入到白色不透明微孔板；加入ＯＴＡ標準或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗ＯＴＡ抗體、生物素化羊抗兔抗體進行標記免疫反應；接著暗處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進行反應后檢測光信號，在光激發下，通過單線態離子氧的產生和傳遞，給發光微粒產生熒光，用光激化學發光檢測儀檢測，光信號強度與樣品中的ＯＴＡ濃度成反比，對照標準曲線計算樣品中的ＯＴＡ含量。本發明專利技術試劑盒結構簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。

【技術實現步驟摘要】

—種檢測赭曲霉毒素A(OTA)的試劑盒及其檢測方法，屬于光激化學發光免疫分 析(LICLIA)
，用于對谷物，飼料及其制品中OTA含量的檢測。
技術介紹
赭曲霉毒素A(OTA)是真菌曲霉ochraceous和幾種Penicillium真菌產生的一種 毒素。OTA已經被證明對動物及人的腎產生損害，也是一種致癌物質，霉菌毒素引起的中毒 大多通過被霉菌污染的糧食，油料作物以及發酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表現 為明顯的地方性和季節性，臨床表現較為復雜，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致 突變等。OTA在大多數谷物中均可分離到，包括大麥、小麥、燕麥、玉米、咖啡豆等，以這些谷 物作為飼料的家禽也會受到污染，因此為了保障人們的健康，開展食品中OTA的衛生檢測 研究是很有必要的。 目前OTA的測定方法有多種，如薄層色譜法，高效液相色譜法，免疫測定法等。色 譜法可以定性、定量，但其儀器設備昂貴，操作復雜且不適用于大批量樣品的檢測。免疫測 定法由于其特異性強，靈敏度高，操作簡便，不需直接接觸毒素，且特別適于大批量樣品的 檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。 光激化學發光免疫分析(LICLIA)是以納米級高分子微粒為基礎的新一代化學發 光技術，該項技術將被廣泛地應用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發產 生的均相化學發光技術。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點。LICLIA 試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發光化合物的發光微粒組成，微粒直徑約188nm， 表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結合，同時，增加微粒的懸浮性。微粒通過水 凝膠表面的功能團與生物分子共價連接。納米級微粒大大增加了反應的表面積，每個微粒 的表面包被著成百上千個生物分子，可捕獲目標分子。 LICLIA技術的核心原理是單線態氧的產生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射 后，感光微粒能使周圍環境中的氧轉化為單線態氧，單線態氧的生存時間僅為4微秒。短暫 的生存時間決定了單線態氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發光微粒在200nm范圍 之內就能接受單線態氧，并發出高能級的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍 內沒有發光微粒，單線態氧就會回落到基態氧而沒有信號產生。這種依賴于兩種微粒相互 接近的化學能量傳遞是LICLIA均相反應的基礎。通常在該反應體系中，微粒的濃度是很低 的。兩種微粒相互隨機碰撞的幾率很低，因此，反應體系的本底非常微弱。如果包被在微粒 表面的生物分子相互作用，拉近了兩個微粒的距離，例如形成免疫夾心復合物，這樣就能產 生能量的有效傳遞并發出光信號。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種檢測OTA的試劑盒及其檢測方法，用于對飼料，谷物 及其制品中OTA含量的檢測。 本專利技術的技術方案一種檢測赭曲霉毒素A，簡稱0TA，的光激化學發光免疫分析 試劑盒，由白色不透明微孔板(l)，赭曲霉毒素A標準(2)，連接赭曲霉毒素A人工抗原的發 光微粒(3)，兔抗赭曲霉毒素A的抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5)，包被有 鏈霉親和素的感光微粒(6)組成。 用所述的試劑盒檢測0TA的方法，取包被有0TA-BSA的發光微粒加入到白色不透 明微孔板；加入0TA標準或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗0TA抗 體、生物素化羊抗兔抗體進行標記免疫反應；接著暗處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒 進行反應后檢測光信號，對照標準曲線計算樣品中的0TA含量。 所述的檢測0TA的方法，其操作為取20 ii L包被有0TA-BSA發光微粒加入到白色 不透明微孔板；加入20 ii L的0TA標準或處理好的樣品到各自的微孔中；加20 y L兔抗0TA 抗體；繼續加入20 ii L生物素化羊抗兔抗體，37t:孵育15分鐘；暗處加175 y L包被有鏈霉 親和素的感光微粒，37t:暗處孵育15分鐘后在光激化學發光檢測儀上檢測光信號，從標準 曲線計算樣品中的OTA含量。 本專利技術的有益效果該檢測試劑盒結構簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。 附圖說明 圖1 :檢測赭曲霉毒素A的試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、0TA標準，3、連接0TA人工抗原的發光微粒，4、兔抗0TA的抗體凍干品，5、生物素化羊抗兔抗體凍干品，6、包被有鏈霉親和素的感光微粒。 圖2 :OTA-LICLIA反應示意圖。 圖3 :OTA-LICLIA標準曲線圖。具體實施例方式實施例l制備試劑盒和檢測玉米樣品 包被有0TA人工抗原的發光微粒制備 在離心管中加入lmg發光微粒，加入12. 5iiL、質量濃度1% Tween-20，0. 05mg 0TA-BSA人工抗原，10iiL硼氫化氰鈉，用pH 6. 0、0. lM的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液 將體積補充到200 ii L， 37t:避光振蕩反應48小時。加入10 y LpH 5. 0、0. 3M的羧甲氧基胺半 鹽酸鹽(CMO)溶液封閉未結合位點，37t:避光孵育1小時后離心，分離得到已連接OTA-BSA 的發光微粒，稀釋后備用。 試劑的配制標準OTA i式劑的配制:標準OTA :0ng/mL，0. lng/mL，0. 5ng/mL， lng/mL， 10ng/mL， 100ng/mL，從0TA純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇水體積比3 : 7。 試劑盒的組成 (1).白色不透明微孔板(12條X8孔，可以拆分為單孔)。 (2). 1 X包被有OTA人工抗原的發光微粒2mL。 (3).6X0TA標準液，1.0ml/瓶，標準液濃度為:O，O. 1，0. 5， 1， 10， 100ng/mL。 (4). 1 X兔抗OTA抗體凍干品，用時2mL蒸餾水溶解。 (5). 1 X生物素化羊抗兔抗體凍干品，用時2mL蒸餾水溶解。 (6). 1 X包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。 測定時注意事項 1.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C )。 2.使用之后立即將所有試劑放回2-8t:。 3.在所有恒溫孵育過程中避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。 具體檢測步驟如下 先將樣品進行處理將玉米樣品粉碎至20目，取5克樣品放在試管中，加入提取液 12. 5mL(甲醇水=7 : 3)。加塞振蕩3分鐘，過濾，濾紙采用新華1號紙。取lmL濾液用 lmL蒸餾水或去離子水進行稀釋，備用。 取20 ii L包被有OTA-BSA發光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20 y L的OTA 標準或處理好的樣品到各自的微孔中；加20iiL兔抗0TA抗體；繼續加入20 y L生物素化羊 抗兔抗體，37t:孵育15分鐘；暗處加175ii L包被有鏈霉親和素的感光微粒，37t:暗處孵育 15分鐘后在光激化學發光檢測儀上檢測光信號，從標準曲線計算樣品中的OTA含量。結果 見表1，由標準曲線求得該例樣品所含OTA濃度為0. 13ng/mL。 表1OTA標準點樣品玉米<table>table see original document page 5</column></row><table> 實施例2大麥樣品測定 試劑盒提供的試劑與實施例本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測赭曲霉毒素Ａ，簡稱ＯＴＡ，的光激化學發光免疫分析試劑盒，其特征是由白色不透明微孔板（１），赭曲霉毒素Ａ標準（２），連接赭曲霉毒素Ａ人工抗原的發光微粒（３），兔抗赭曲霉毒素Ａ的抗體凍干品（４），生物素化羊抗兔抗體凍干品（５），包被有鏈霉親和素的感光微粒（６）組成。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃飚，張玨，張藝，陳蘊，金堅，
申請(專利權)人：江蘇省原子醫學研究所，
類型：發明
國別省市：32[中國|江蘇]