【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于糖化學生物學領域，具體涉及一種雙硫功能化二糖金納米探針、制備方法及其在檢測刀豆蛋白a(cona)方面的應用。
技術介紹
0、技術背景
1、刀豆蛋白a(concanavalin?a,cona)最初是在1936年由sumner和howell從洋刀豆種子中分離到的一種豆科凝集素。具有強效的促有絲分裂和激發淋巴細胞轉化的作用，還能選擇性激活抑制性t(ts)細胞，在細菌、病毒感染和癌細胞轉移等免疫調節反應中發揮重要作用。凝集素cona存在于多種豆科植物中，是由單體組成的多聚蛋白，一般以四聚體形式存在，具有四個糖基的結合位點。
2、凝集素cona具有很高的毒性，可能會導致一些人出現過敏反應，如頭痛、惡心、腹瀉等。食用大量含有cona的食物可能引起食物中毒，對腎臟功能產生不良影響。除此之外，cona已被證明可以誘導血凝，并且還具有交聯細胞受體的能力，從而導致活化和細胞粘附，特異性地沉積在肝臟中，誘導急性肝炎和免疫介導的肝損傷(toxicology?and?appliedpharmacology,2016,290:86-97.world?journal?of?gastroenterology,2012,18(2):119-125.)。
3、納米傳感器現已成為分析檢測領域高效的研究工具。其中aunps由于其優異的光電性質已成功用于多種目標的檢測(food?bioscience,2023,56.)，同時還具有易與多種功能性分子結合，對多種熒光團的高淬滅效率等特性，具有靈敏度高、特異性強、響應速度快等
4、本專利技術擬制備一種基于二糖配體與雙硫配體合成修飾的金納米探針，用于檢測刀豆蛋白a(cona)。在該系統中，二糖配體修飾的金納米顆粒用作淬滅劑，應用于刀豆蛋白a的檢測和活性抑制，有望提高檢測的靈敏度、特異性和速度，為食品安全、醫學研究、生物技術和環境監測等領域提供有力的工具。
技術實現思路
1、本專利技術目的是提供一種雙硫功能化二糖金納米探針、制備方法及其在檢測刀豆蛋白a(cona)方面的應用。
2、一種雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，其結構如下式所示：
3、
4、其中n＝1～10r＝甘露糖二糖或者麥芽糖，x為1～1500。
5、所述的雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，所述甘露糖二糖或者麥芽糖，其結構如下示：
6、
7、所述的雙硫功能化二糖金納米探針的制備方法，其特征在于，按如下步驟實現：
8、將1摩爾的金納米粒子、1～2000摩爾的雙硫功能化糖配體i-1-1-diman和三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽溶于水，室溫避光攪拌12h～24h，離心濃縮，水洗，制備雙硫功能化糖納米探針其反應式為：
9、
10、其中n＝1～10r＝甘露糖二糖或者麥芽糖，x為1～1500。。
11、所述的雙硫功能化二糖金納米探針的制備方法，其特征在于，所述的雙硫功能化糖配體i-1-1-diman由雙硫配體i-1-1-2s，叔丁基三氯乙酰亞胺酯，五水合硫酸銅和抗壞血酸鈉，采用點擊化學，具體反應步驟如下：
12、
13、其中：所述的雙硫配體i-1-1-2s與配體diman、叔丁基三氯乙酰亞胺酯、五水合硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為1:2～3:0.08～0.3:0.03～0.2:0.1～1，溶劑甲醇或者乙醇，室溫避光攪拌，產物柱層析分離提純。
14、所述的雙硫功能化二糖金納米探針在制備刀豆蛋白a檢測試劑中的應用。
15、具體而言：
16、雙硫功能化二糖金納米探針的制備如下：
17、將1摩爾的金納米粒子、1～2000摩爾的雙硫功能化糖配體i-1-1-diman和三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽溶于超純水，室溫避光攪拌12h～24h，離心濃縮，水洗，制備雙硫功能化糖納米探針，其過程為：
18、
19、通式ⅰ-1-1-diman所示的雙硫功能化糖配體由雙硫配體i-1-1-2s、配體diman、叔丁基三氯乙酰亞胺酯、五水合硫酸銅和抗壞血酸鈉，經點擊化學制備。其中，雙硫配體i-1-1-2s與配體diman、叔丁基三氯乙酰亞胺酯、五水合硫酸銅和抗壞血酸鈉的摩爾比為1:2～3:0.08～0.3:0.03～0.2:0.1～1，溶劑甲醇或者乙醇，室溫避光攪拌，產物柱層析分離提純。具體反應步驟如下：
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21、通式diman所示的二糖配體的合成參照文獻j.am.chem.soc.2017,139,11833-11844，以甘露糖和全乙酰甘露糖為原料，分別與三溴化磷、乙酸酐、乙酸肼、三氯乙睛和dbu反應，制備r1-4和r1-5。低溫條件下與三氟化硼乙醚溶液反應，制備r1-3，參照r1-5的合成制備r1-2。將r1-2依次與h(och2ch2)n+2c1和nan3反應，制備r1-1。最后將r1-1在堿性條件下水解，制備甘露二糖diman(r1)，具體反應式如下：
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23、通式i-1-1-2s所示的雙硫配體的合成：0℃下，將dl-硫辛酸和二環己基碳二亞胺溶于二氯甲烷，攪拌反應30min，至有白色渾濁出現，加入化合物i-1-1和催化劑4-二甲氨基吡啶，繼續攪拌30min，之后緩慢升至室溫攪拌12～24h。過濾，將濾液旋蒸除去溶劑得黃色粘稠物，經柱層析分離提純得產品，為淡黃色固體。具體反應式如下：
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25、所述二糖配體，r基團為甘露糖二糖或者麥芽糖，結構如下圖所示：
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27、檢測機制
28、本專利技術結構中，r基團(甘露糖二糖或者麥芽糖)主要起到識別作用，乙二醇鏈主要便于探針分子空間折疊，更好的和cona結合，i-1-1-2s結構部分電子容易轉移，容易與cona結合；硫辛鍵與金納米粒子區域，提升了反應活性。
29、cona四聚體具有四個糖基的結合位點，cona與ⅰ-1-1-diman-aunps之間可發生fret反應。當cona和ⅰ-1-1-diman-aunps混合時，特定的結合位點會導致能量從cona轉移到aunps，從而淬滅cona的熒光，使系統切換到“關閉”狀態。此時，熒光光譜強度受到抑制，而這種抑制程度會隨著ⅰ-1-1-diman-aunps濃度的增加而增強，在一定范圍內呈線性關系。因此可以基于此原理構建一個對微痕量cona熒光檢測的方法。(檢測機理見圖4)。
30、有益效果
31、本專利技術基于點擊化學和配體交換，將二糖配體修飾于金納米粒子表面，構建全新結構的雙硫功能化糖納米探針，該探針未見文獻報道，基于熒光淬滅策略，研究其與刀豆蛋白a(cona)的糖結合機制，對cona產生80％左右的熒光淬滅，從而抑制cona的生物學活性，有望應用于預測針對cona驅動的病毒感染。該探針，靈敏度高，cona檢測線低至5.02nmol/l本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，其結構如下式所示：
2.如權利要求1所述的雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，所述甘露糖二糖或者麥芽糖，其結構如下示：
3.如權利要求1或2所述的雙硫功能化二糖金納米探針的制備方法，其特征在于，按如下步驟實現：
4.如權利要求3所述的雙硫功能化二糖金納米探針的制備方法，其特征在于，所述的雙硫功能化糖配體I-1-1-DiMan由雙硫配體I-1-1-2S，叔丁基三氯乙酰亞胺酯，五水合硫酸銅和抗壞血酸鈉，采用點擊化學，具體反應步驟如下：
5.如權利要求1或2所述的雙硫功能化二糖金納米探針在制備刀豆蛋白A檢測試劑中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，其結構如下式所示：
2.如權利要求1所述的雙硫功能化二糖金納米探針，其特征在于，所述甘露糖二糖或者麥芽糖，其結構如下示：
3.如權利要求1或2所述的雙硫功能化二糖金納米探針的制備方法，其特征在于，按如下步驟實現：
4.如權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李玲，劉媛媛，季臺隆，黃新玥，
申請(專利權)人：東南大學成賢學院，
類型：發明
國別省市：
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