抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的RNA、重組體及其應用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ＦＰＮ?。保┍磉_的小干擾性ＲＮＡ。本發(fā)明專利技術(shù)進一步公開了編碼所述小干擾性ＲＮＡ的相應ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ以及能表達所述ＲＮＡ的重組體。本發(fā)明專利技術(shù)的小干擾性ＲＮＡ、ＤＮＡ以及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達、抑制鐵的釋放與代謝，調(diào)節(jié)體內(nèi)的血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關(guān)疾病的目的。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及分子生物學、生物醫(yī)藥及基因工程
，具體涉及利 用逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus)介導的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對人膜鐵轉(zhuǎn)運 蛋白(FPN1)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾體系(Retro-FPN)，并將其運用到鐵 代謝相關(guān)疾病的藥物開發(fā)制備當中。
技術(shù)介紹
RNAi指的是當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA 時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象。RNA干擾過程主要有2個步驟(1)長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (2)小干擾性RNA與細胞源性的某些 酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，該復合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的 mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。1998年，安德魯'法厄(Andrew Z. Fire)等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans) 中進行反義RNA抑制實驗時發(fā)現(xiàn)，作為對照加入的雙鏈RNA相比正鏈或 反鏈RNA顯示出了更強的抑制效果(Fireetal., 1998)。從與靶mRNA的 摩爾比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強于理論上1:1配對時的抑制 效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應并且有 某種酶活性參與其中。隨后，又相繼發(fā)現(xiàn)具有RNase III活性的Dicer可將 長的雙鏈RNA加工成稱之為siRNA (small interfering RNA)的21 23nt 及3 '端突出的短的雙鏈RNA， siRNA與若干個蛋白組成稱之為RISC復合 物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白復合物，并由該復合物 主導RNAi效應。2001年，Tuschl等將短的siRNA導入到哺乳動物細胞 中并由此解決了在哺乳細胞內(nèi)導入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應， 由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景。RNAi機制普遍存在于生物種 中，因此被認為是進化上相對保守的基因表達調(diào)控機帝'J。一種假說為，RNAi 機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機制中的相關(guān)一些因子如內(nèi)源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調(diào)控，其范 圍已經(jīng)超越了 PTGS (post transcriptional gene silencing)，如RNAi機制同 樣參與了轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達調(diào)控過程中。2006年，安德魯'法厄與克 雷格.梅洛(Craig C.Mdlo)由于在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生 理及醫(yī)學獎。由外界導入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的 RNA酶切割成21~23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作small interfering RNA(siRNA)，其特征是3'端相對于互補鏈突出兩個堿基。完成 上述過程后，siRNA上結(jié)合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白復合物。在RISC復合物中，siRNA 依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉(zhuǎn)換為單鏈，進而RISC被活化。活化型 RISC受已成單鏈的siRNA引導(guide strand),序列特異性地結(jié)合在標靶 mRNA上并切斷標耙mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。迄今為止已 鑒定出包括Dicer在內(nèi)的若干個與RNAi有關(guān)的蛋白因子。在果蠅 (Drosophila melanogaster) RISC中，已知存在著稱為Argonaute2(AG02) 的因子，AG02蛋白的表達受到抑制時，RNAi效應缺失，也就是說AG02 是果蠅RNAi機制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切 割酶活性(slicer activity), RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主導。另外，幾個RNA解旋酶(RNA helicase)也被鑒定為參與 RNAi機制的因子。在秀麗隱桿線蟲(C. degans)的RNAi中必須的因子 有EGO 1 ，這是一種RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存 在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標靶mRNA作為模板，以導入的 dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA，在細胞內(nèi)針對于標靶mRNA合成 新siRNA的酶。這一反應在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在 人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機制的基 本框架雖然相同，但存在著微妙差異。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究 的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi 模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(GOF) 方法更具優(yōu)勢。因此,RNAi在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標確認的一個重4要工具。同時，那些在耙標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以 被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。在藥物靶標發(fā)現(xiàn)和確認方面，RNAi技術(shù)已獲得了廣泛的應用。生物 技術(shù)公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然后通過 觀察細胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的 腫瘤細胞生長來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。 一旦所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)儆诳捎盟幍?靶標(如表達的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外)，就可以針對此靶標 進行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標還可用RNAi技術(shù)在細胞水 平或動物體內(nèi)進一步確認。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA 已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。然而要將RNA 干擾技術(shù)運用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達效 率等重要問題。shRNA即短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA)。在RNAi感染過程中，產(chǎn) 生dsRNA的一個有效方法就是在體內(nèi)表達一個短發(fā)夾RNA，這種shRNA 包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop 序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，從而降 解目的基因抑制其表達。1831年，F(xiàn)ordisch證明缺鐵性貧血患者血液中鐵含量比健康人低，確認 了鐵是人體必需微量元素之一。鐵廣泛參與機體的代謝過程，如血紅蛋白、 肌紅蛋白、激素以及DNA等的合成,還能增強中性粒細胞殺菌及吞噬功能， 維護T、 B細胞增殖、分化及抗體的產(chǎn)生(Folin等.1991)。長期以來，人們對 鐵與健康的關(guān)系，多著眼于鐵缺乏的危害，如導致缺鐵性貧血、缺鐵吞咽困 難綜合征等疾病。然而，近年來有關(guān)鐵過多引起的健康問題越來越引起人 們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，過多的鐵會產(chǎn)生有毒性的自由基，繼而損傷細胞， 造成遺傳性血色素病、神經(jīng)退行性疾病等。因此，體內(nèi)必需具有嚴格的調(diào)節(jié) 機制,以保持鐵代謝的平衡。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroportinl， FPN1)，又稱鐵 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運體l本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種抑制人膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ＦＰＮ?。保┍磉_的ＲＮＡ，其特征在于：所述ＲＮＡ含有以下序列：　Ｓｅｑ?。桑摹。危铮保海怠粒牵粒茫眨粒眨粒粒眨牵粒眨粒粒茫粒茫眨场?。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：錢忠明，葛嘯虎，柯亞，
申請(專利權(quán))人：香港理工大學深圳研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：94[中國|深圳]