【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種分離純化方法，具體涉及一種分離純化原花青素二聚體的方法。
技術介紹
1、原花青素(proanthocyanidins，pc)廣泛存在于植物中，為一類由不同數量的黃烷-3-醇單體縮合而成的聚多酚類物質，主要由兒茶素(catechin，c)和表兒茶素(epicatechin，ec)等組成，其因在酸性介質下加熱生成相應的花色素而得名。最簡單的原花青素是兒茶素與表兒茶素單體。此外，還有二聚體、三聚體、四聚體等，直至十聚體。按聚合度大小，通常將2～4聚體稱為低聚原花青素(oligomeric?proanthocyanidins，opc)，將五聚體以上稱為高聚原花青素(polymeric?proanthocyanidins，ppc)。opc具有較強的抗氧化性、清除自由基能力和改善人體微循環的能力，是目前發現的最強、最有效的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑之一。opc在體內的抗氧化效果遠高于維生素e和維生素c，其在體內抗氧化能力約為維生素e的50倍，維生素c的20倍。
2、pc在人體內的吸收是通過腸道微生物的分解作用，而這種分解只針對單體和二聚體。當分子量變大，分解作用也極低，可能的原因是高聚原花青素的分子量比低聚體大，受到空間位阻的影響更大，所以高聚體的抗氧化能力低于低聚體。因此，有必要對pc進行分離純化來提高其使用價值。
3、在原花青素中，opc的活性，尤其是二聚體要遠大于高聚體ppc。且由于ppc結構復雜，且聚合度越大，水溶性越差，不易于人體吸收，降低了生物利用率，在實際應用中制約了原花青素的發
4、中國專利申請cn1454896a公開了一種葡萄籽低聚原花青素的提取方法，該方法首先是將葡萄籽進行粉碎、過篩、脫脂，再經含無機礦酸的有機溶劑提取、無機堿中和、減壓濃縮后即可得到原花青素粗提物，再將粗提物中加入石油醚或三氯甲烷，放置、過濾、干燥得到精制原花青素；雖然該專利技術能夠得到低聚原花青素，但該專利技術沒有對復雜的原花青素組分進行分離，得到的原青花素聚合度不夠均一，且雖是低聚原花青素，但聚合度還是偏高。
5、中國專利cn202110284690.8公開了一種連續化制備低聚原花青素的方法，該方法在對平均聚合度接近的原花青素低聚物產品進行抗氧化活性測試時發現，即使平均聚合度相同，抗氧化活性卻差異較大。可能由于平均聚合度是通過香草醛鹽酸等方法實驗得到，并不能證明原花青素低聚物產品的均一性。
6、中國專利申請cn102690858a公開一種葡萄籽原花青素的制備方法，將葡萄籽經加水磨漿、加葡萄糖配料、高溫滅菌、接菌發酵、離心除渣、超濾提取、干燥等工藝制成葡萄籽原花青素；但該專利技術發酵劑的制備步驟繁瑣，成本較高，最后得到的原花青素聚合度不均一。
7、目前，國內原花青素的提取分離多數停留在低聚原花青素的階段，通過香草醛鹽酸等方法間接測出低聚原花青素的平均聚合度，然后再進行抗氧化能力測定。但是，此方法存在較大誤差且并沒有分離純化出單一聚合度的低聚原花青素。因此，亟待尋求一種能分離純化出高活性、均一聚合度的低聚原花青素的新方法。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的問題，為提高原花青素聚合度的均一性，降低平均聚合度，本專利技術提供一種分離純化原花青素二聚體的方法；本專利技術方法得到的原花青素二聚體純度高、產率高、聚合度均一、抗氧化性強。
2、本專利技術解決其技術問題采用的技術方案如下：
3、一種分離純化原花青素二聚體的方法，包括如下步驟：
4、(1)萃取分液：將原花青素提取物溶解于去離子水中，加入乙酸乙酯萃取，濃縮得原花青素低聚物；
5、(2)凝膠柱分離純化：采用葡聚糖凝膠柱層析，用甲醇洗脫凝膠柱，收集不同時間的組分，得含低聚原花青素的洗脫液；
6、(3)液相檢測分析：使用c18分析柱，采用梯度洗脫分析各組分成分；檢測后合并相同組分，旋蒸濃縮。
7、本專利技術方法得到的原花青素二聚體純度高、聚合度均一、抗氧化性強。
8、在具體的實施方案中，步驟(1)中，所述的原花青素提取物的來源包括但不限于葡萄籽原花青素、藍莓原花青素、越橘原花青素的任意一種，可商業購買也可根據現有技術自行提取。
9、在具體的實施方案中，步驟(1)中，萃取次數為3次，每次萃取按相同比例，萃取時乙酸乙酯相與水相的比例為2～4:1，具體可為2：1、3：1、4：1等，最后把3次萃取的乙酸乙酯相收集混合后經旋轉蒸發得原花青素低聚物。
10、在具體的實施方案中，所述步驟(1)中，濃縮時使用的是真空旋轉蒸發，溫度為40℃。
11、在具體的實施方案中，步驟(2)中，所述的葡聚糖凝膠柱采用羥丙基交聯葡聚糖凝膠(sephadex?lh-20)自行填充，所述的葡聚糖凝膠柱的徑高比為1：40～100，上柱的流速為0.3-0.8bv/h。葡聚糖凝膠柱根據原花青素的分子量大小進一步對原花青素分離純化，得到不同聚合度的原花青素。
12、在具體的實施方案中，步驟(2)中，所述的葡聚糖凝膠柱采用濕法上樣，上樣量為葡聚糖凝膠柱體積的1％～4％，溫度保持在15-40℃之間，。保持層析填料在一個相同的溶脹系數之下，以免層析柱在洗脫時產生氣泡，影響柱子分離效果。
13、在具體的實施方案中，步驟(2)中，所述的洗脫劑甲醇等度洗脫時采用的濃度是100％，總洗脫體積為10～30個柱體積，此時原花青素能夠按聚合度分離，得到不同聚合度的原花青素。原花青素二聚體組分從洗脫開始第5～15個柱體積開始收集。
14、在具體的實施方案中，步驟(2)中，所述的含低聚原花青素的洗脫液收集先后順序分別為第i組分(e、ec)、第ii組分(原花青素二聚體)、第iii組分(其他原花青素低聚物成分)。
15、在具體的實施方案中，步驟(3)中，所使用的c18柱為inertsustain?c18，長度250mm，色譜柱內徑4.6mm，粒徑5μm。
16、在具體的實施方案中，步驟(3)中，所使用的梯度洗脫程序為流動相a：0.05％三氟乙酸-乙腈，流動相b：0.05％三氟乙酸-水；梯度洗脫：0～5min，10％?a，90％?b；5min，10％a，90％?b；20min，35％?a，65％?b；25min，10％?a，90％?b；25～30min，10％?a，90％?b；流速1ml/min(此為a、b流動相每個時刻的濃度)；檢測波長280nm；柱溫25℃；進樣體積10μl。
17、有益效果：將原花青素提取物溶于水中，經過乙酸乙酯萃取之后得到原花青素低聚物，隨后上樣于葡聚糖凝膠柱，這種柱子提供了較小孔徑的凝膠顆粒，能夠有助于得到聚合度均一的原花青素低聚物產品，實現不同聚合度的原花青素分離；然后根據高效液相檢測合并相同組分，收集即可；最后對不同組分的原花青素進行抗氧化活性測定。原花青素低聚物中，原花青素二聚體含量相本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種分離純化提取物中原花青素二聚體的方法，其特征在于，所述包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，原花青素提取物的來源為葡萄籽原花青素、藍莓原花青素、越橘原花青素中的一種或多種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，萃取使用的有機溶劑是乙酸乙酯，乙酸乙酯與水相的比例為2～4:1，萃取的次數為3次。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，濃縮時使用的是真空旋轉蒸發，溫度為40℃。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，葡聚糖凝膠柱采用羥丙基交聯葡聚糖凝膠自行填充。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的葡聚糖凝膠柱的徑高比為1：40～100，上柱的流速為0.3-0.8BV/h；采用濕法上樣，上樣量為葡聚糖凝膠柱體積的1％～4％，上樣溫度為15～40℃。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，使用純甲醇等度洗脫，洗脫體積為10～30個柱體積。
8.如權利要求1所述的方法，其特
...【技術特征摘要】
1.一種分離純化提取物中原花青素二聚體的方法，其特征在于，所述包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，原花青素提取物的來源為葡萄籽原花青素、藍莓原花青素、越橘原花青素中的一種或多種。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，萃取使用的有機溶劑是乙酸乙酯，乙酸乙酯與水相的比例為2～4:1，萃取的次數為3次。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，濃縮時使用的是真空旋轉蒸發，溫度為40℃。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王越，胡碩，彭凱，嚴然，葉寶芬，趙俊凱，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：
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