【技術實現步驟摘要】
本申請涉及微生物發酵生產的，更具體地說，它涉及一種雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法。
技術介紹
1、酮基-d-葡萄糖酸，又被稱為2-酮-d-葡萄糖酸，是一種葡萄糖酸的衍生物，其在食品、醫藥、毛紡、電鍍、飼料加工、工業水處理及石油化工領域均有廣泛應用，同時，還可以直接作為食品添加劑使用。另外，2-酮基-d-葡萄糖酸還可以通過進一步的化學反應生成其他具有高附加值的化合物，如2-丁二醇、丁二酸等，因此，酮基-d-葡萄糖酸的生產和應用對于促進經濟發展和改善人民生活具有重要意義。
2、國內外普遍采用生物發酵和化學合成相結合的工藝制備2-酮基-d-葡萄糖酸，其主要過程是將淀粉用酶水解生成葡萄糖，然后用細菌以葡萄糖為底物發酵生產2-酮基-d-葡萄糖，然后再進行化學合成得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
3、在工業化生產中，通常采用葡萄糖和玉米漿分別作為2-酮基-d-葡萄糖酸發酵的碳源和氮源，但是上述工藝生產存在著高濃度發酵周期長、菌種不耐高滲透壓等缺點，而且，發酵原料對發酵轉化率、發酵產量、產物質量及生產成本均具有顯著影響，發酵液成分復雜、雜質多、分離提純難度大也將影響產物的收率和質量，因此，在不影響產品質量的前提下，提高原料利用率，提高生產強度等技術要求是本行業亟需去解決的問題。
技術實現思路
1、為了改善常規2-酮基-d-葡萄糖酸生產工藝中原料利用率低，生產強度差的缺陷，本申請提供一種雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法。
2、本申請提供的一種雙酶催
3、一種雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其步驟為：以玉米淀粉水解糖為底物，向玉米淀粉水解糖中添加葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液，反應24-48h，得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
4、優選的，所述葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液的制備方法為：取沙雷氏菌接種至lb液體培養基中，置于25-40℃、150-200rpm的條件下培養至菌液od值為0.6-0.8，加入誘導劑iptg至其終濃度為0.4-0.6mm，置于15-20℃、100-120rpm誘導表達16h，將培養液于4℃條件下7000-10000rpm離心5-10min收集菌體，然后將菌體重懸于緩沖液中，經破碎純化后，加入同濃度的葡萄糖脫氫酶/葡萄糖酸脫氫酶，得到葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液。
5、沙雷氏菌利用特定的膜孔蛋白以協助擴散的方式攝取葡萄糖，而在葡萄糖進入周質空間后，可被膜結合的葡萄糖脫氫酶催化氧化為葡萄糖酸，之后再被膜結合的葡萄糖酸脫氫酶催化氧化為2-酮基-d-葡萄糖酸，相較于常規的生物發酵生產來說，本申請的雙酶協同生產方式具有更高的原料利用率，進而提高生產強度。
6、優選的，所述葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液為依次加入，具體為，先加入葡萄糖脫氫酶處理液，反應12-24h，再加入葡萄糖酸脫氫酶處理液，繼續反應12-24h。
7、相對于將葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液混合添加來說，將葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液依次加入的方式可以促使葡萄糖有序且準確地依次轉化為葡萄糖酸及2-酮基-d-葡萄糖酸。
8、優選的，所述葡萄糖酸脫氫酶處理液與所述葡萄糖脫氫酶處理液的摩爾濃度比為1：（90-110）。
9、優選的，所述葡萄糖脫氫酶處理液與所述玉米淀粉水解糖的摩爾濃度比為1：（900-1100）。
10、優選的，所述玉米淀粉水解糖濃度為10-1000g/l。
11、優選的，反應時控制底物溶液ph值介于1-10。
12、優選的，反應時控制反應溫度介于20-50℃。
13、當所述葡萄糖酸脫氫酶處理液、所述葡萄糖脫氫酶處理液及玉米淀粉水解液采用上述濃度，同時控制ph值介于1-10，溫度控制于20-50℃時，本申請的雙酶協同生產方式具有更高的原料利用率，進而提高生產強度。
14、優選的，所述雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法采用雙酶催化罐進行；
15、所述雙酶催化罐包括催化罐、葡萄糖脫氫酶罐及葡萄糖酸脫氫酶罐，所述催化罐的上端面設置有驅動電機，所述驅動電機的輸出端設置有主動齒輪，所述葡萄糖脫氫酶罐的外周面轉動連接有從動齒輪，所述主動齒輪與所述從動齒輪相互嚙合；
16、所述從動齒輪上設置有按壓塊一，所述按壓塊一的端面設置有圓弧面，所述葡萄糖酸脫氫酶罐上設置有用于啟閉所述葡萄糖酸脫氫酶罐的閥門的開關一，所述從動齒輪驅使所述按壓塊一與所述開關一抵接。
17、在葡萄糖脫氫酶添加完畢后，驅動電機開始運行，驅動電機驅使主動齒輪發生旋轉，主動齒輪帶動從動齒輪發生旋轉，進而進行計時，在到達指定時間后，按壓塊一的圓弧面與開關一抵接，進而開啟葡萄糖酸脫氫酶罐的閥門，完成葡萄糖酸脫氫酶的輸送，促使葡萄糖脫氫酶及葡萄糖酸脫氫酶的輸送更為及時。
18、優選的，所述葡萄糖脫氫酶罐上設置有漂浮件，所述漂浮件包括漂浮板、連接桿及連接塊，所述漂浮板容置于所述葡萄糖脫氫酶罐內，所述連接桿固定連接于所述漂浮板上，所述連接桿穿出所述葡萄糖脫氫酶罐并往復滑移于所述葡萄糖脫氫酶罐上，所述連接塊固定連接于所述連接桿遠離所述漂浮板的一端；
19、所述連接塊的底部設置有按壓塊二，所述催化罐的頂部設置有用于啟閉所述驅動電機的開關二，所述漂浮板的下移驅使所述按壓塊二與所述開關二抵接。
20、在葡萄糖脫氫酶添加的過程中，漂浮板在重力的作用下逐漸下移，從而帶動按壓塊二同步下移，當葡萄糖脫氫酶添加完畢后，漂浮板觸底，而按壓塊二恰好與開關二抵接，進而迫使驅動電機開啟，進一步提高葡萄糖脫氫酶及葡萄糖酸脫氫酶輸送的及時性。
21、優選的，所述主動齒輪轉動連接于所述連接塊的下端面，所述主動齒輪的中心開設有鍵槽，所述驅動電機的輸出端設置有鍵塊，所述鍵塊活動插接于所述鍵槽內。
22、在按壓塊二與開關二抵接之前，鍵塊首先插接于鍵槽內，從而促使驅動電機可以通過鍵塊及鍵槽帶動主動齒輪發生旋轉，而上述設置可以起到雙重保險的作用，在誤觸開關二后，由于主動齒輪的安裝還未到位，從動齒輪將難以發生運行。
23、優選的，所述連接塊與所述從動齒輪之間始終存在間隙，所述按壓塊一的側壁設置有導向面，所述導向面迫使所述連接塊向遠離所述從動齒輪的方向移動。
24、在葡萄糖酸脫氫酶添加完畢后，按壓塊一逐漸脫離開關一，此時，導向面將與連接塊抵接，從而促使連接塊在導向面的作用下逐漸上移，進而迫使按壓塊二逐漸脫離開關二，進而完成驅動電機的關閉操作。
25、綜上所述，本申請具有以下有益效果：
26、沙雷氏菌利用特定的膜孔蛋白以協助擴散的方式攝取葡萄糖，而在葡萄糖進入周質空間后，可被膜結合的葡萄糖脫氫酶催化氧化為葡萄糖酸，之后再被膜結合的葡萄糖酸脫氫酶催化氧化為2-酮基-d-葡萄糖酸，相較于常本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，其步驟為：以玉米淀粉水解糖為底物，向玉米淀粉水解糖中添加葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液，反應24-48h，得到2-酮基-D-葡萄糖酸。
2.根據權利要求1所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液的制備方法為：取沙雷氏菌接種至LB液體培養基中，置于25-40℃、150-200rpm的條件下培養至菌液OD值為0.6-0.8，加入誘導劑IPTG至其終濃度為0.4-0.6mM，置于15-20℃、100-120rpm誘導表達16h，將培養液于4℃條件下7000-10000rpm離心5-10min收集菌體，然后將菌體重懸于緩沖液中，經破碎純化后，加入同濃度的葡萄糖脫氫酶/葡萄糖酸脫氫酶，得到葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液。
3.根據權利要求2所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液為依次加入，具體為，先加入葡萄糖脫氫酶處理液，反應12-24h，再加入葡萄糖酸脫氫
4.根據權利要求3所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖酸脫氫酶處理液與所述葡萄糖脫氫酶處理液的摩爾濃度比為1：（90-110）。
5.根據權利要求4所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脫氫酶處理液與所述玉米淀粉水解糖的摩爾濃度比為1：（900-1100）。
6.根據權利要求5所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：反應時控制底物溶液pH值介于1-10，控制反應溫度介于20-50℃。
7.根據權利要求1所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法采用雙酶催化罐（1）進行；
8.根據權利要求7所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脫氫酶罐（2）上設置有漂浮件（24），所述漂浮件（24）包括漂浮板（241）、連接桿（242）及連接塊（243），所述漂浮板（241）容置于所述葡萄糖脫氫酶罐（2）內，所述連接桿（242）固定連接于所述漂浮板（241）上，所述連接桿（242）穿出所述葡萄糖脫氫酶罐（2）并往復滑移于所述葡萄糖脫氫酶罐（2）上，所述連接塊（243）固定連接于所述連接桿（242）遠離所述漂浮板（241）的一端；
9.根據權利要求8所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述主動齒輪（12）轉動連接于所述連接塊（243）的下端面，所述主動齒輪（12）的中心開設有鍵槽（14），所述驅動電機（11）的輸出端設置有鍵塊（15），所述鍵塊（15）活動插接于所述鍵槽（14）內。
10.根據權利要求9所述的雙酶催化生產2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述連接塊（243）與所述從動齒輪（21）之間始終存在間隙，所述按壓塊一（22）的側壁設置有導向面（25），所述導向面（25）迫使所述連接塊（243）向遠離所述從動齒輪（21）的方向移動。
...【技術特征摘要】
1.一種雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于，其步驟為：以玉米淀粉水解糖為底物，向玉米淀粉水解糖中添加葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液，反應24-48h，得到2-酮基-d-葡萄糖酸。
2.根據權利要求1所述的雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液的制備方法為：取沙雷氏菌接種至lb液體培養基中，置于25-40℃、150-200rpm的條件下培養至菌液od值為0.6-0.8，加入誘導劑iptg至其終濃度為0.4-0.6mm，置于15-20℃、100-120rpm誘導表達16h，將培養液于4℃條件下7000-10000rpm離心5-10min收集菌體，然后將菌體重懸于緩沖液中，經破碎純化后，加入同濃度的葡萄糖脫氫酶/葡萄糖酸脫氫酶，得到葡萄糖脫氫酶處理液/葡萄糖酸脫氫酶處理液。
3.根據權利要求2所述的雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脫氫酶處理液及葡萄糖酸脫氫酶處理液為依次加入，具體為，先加入葡萄糖脫氫酶處理液，反應12-24h，再加入葡萄糖酸脫氫酶處理液，繼續反應12-24h。
4.根據權利要求3所述的雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖酸脫氫酶處理液與所述葡萄糖脫氫酶處理液的摩爾濃度比為1：（90-110）。
5.根據權利要求4所述的雙酶催化生產2-酮基-d-葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述葡萄糖脫氫酶處理液與所述玉米淀粉水解糖的摩爾濃度比為1：（900-1100）。
...【專利技術屬性】
技術研發人員：盧正東，雷華，史建勛，王維，鄒榮華，黃佳佳，
申請(專利權)人：廣濟藥業濟寧有限公司，
類型：發明
國別省市：
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