【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測，具體涉及一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr方法及試劑盒和應用。
技術介紹
1、鼻炎是由病毒、細菌、過敏原等引起的鼻腔黏膜炎癥，可能源自各種理化因素或某些全身性疾病。眾多類型中，最常見的是過敏性鼻炎，其由塵螨、霉菌、寵物、花粉等過敏原引發(fā)，存在遺傳傾向。非過敏性鼻炎則由病毒、細菌、刺激性氣味及溫度變化等因素引發(fā)，包含血管運動性鼻炎、萎縮性鼻炎、激素性鼻炎等。急性鼻炎，又稱為“傷風”、“感冒”，是由多種上呼吸道病毒感染引發(fā)，具有一定的傳染性，而慢性鼻炎則是鼻腔黏膜及下層的慢性炎癥，病程持續(xù)數月以上，反復發(fā)作。
2、鼻炎的主要癥狀包括鼻塞、打噴嚏、流鼻涕和鼻癢，但具體表現可以根據鼻炎類型差異。急性鼻炎初期常表現為鼻內干燥、灼熱或癢感，最后發(fā)展為閉塞性鼻音、嗅覺減退等。而慢性鼻炎主要癥狀則是鼻塞和鼻涕增多，也可能出現頭痛、鼻根部不適等癥狀。如果病情嚴重，炎癥還可能影響到其他上呼吸道部位與下呼吸道，引發(fā)咽喉炎、中耳炎、氣管炎、支氣管炎及肺炎等并發(fā)癥。
3、急性鼻炎是由上呼吸道病毒感染，或合并細菌感染引起，已知有100多種病毒可引起該病，其中最常見的有人鼻病毒、人腺病毒等。
4、pcr技術的基本原理類似于dna的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，pcr由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①模板dna的變性：模板dna經加熱至93℃左右一定時間后，使模板dna雙鏈或經pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下
技術實現思路
1、為解決上述問題，本專利技術公開了一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr方法及試劑盒，其能夠同時對3種呼吸道病原體進行快速檢測，具有非常高的靈敏度。
2、為達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：
3、本專利技術提供一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr試劑盒，包括管1試劑和tap酶；所述管1試劑包括pcr引物探針緩沖液、病原體引物探針、人dna內參引物探針；其中，管1試劑內靶標為人鼻病毒、人腺病毒、人副流感病毒；
4、所述pcr引物探針緩沖液包括：
5、人鼻病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物、檢測探針；
6、人腺病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物、檢測探針；
7、人副流感病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物、檢測探針；
8、人dna內參的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物、檢測探針；
9、人鼻病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物及檢測探針的序列分別如seq?idno.1～seq?id?no.3所示；
10、人腺病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物及檢測探針的序列分別如seq?idno.4～seq?id?no.6所示；
11、人副流感病毒的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物及檢測探針的序列分別如seq?id?no.7～seq?id?no.9所示；
12、人dna內參的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物及檢測探針的序列分別如seqid?no.10～seq?id?no.12所示。
13、進一步地，所述人鼻病毒的檢測探針序列5’端標記有fam發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq1；所述人腺病毒的檢測探針序列5’端標記有rox發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2；所述人副流感病毒的檢測探針序列5’端標記有vic發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq1；
14、進一步地，所述人dna內參的檢測探針序列5’端標記有cy5發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2。
15、進一步地，所述管1試劑的所述病原體引物濃度均為0.1μm，所述病原體探針濃度為0.05μm，所述人dna內參引物濃度為0.06μm，所述人dna內參引物探針濃度為0.03μm。
16、進一步地，所述pcr引物探針緩沖液具體成分還包括：200mm?tris-hcl，30mm?kcl，10mm?mgcl2，30mm硫酸銨，400μm?dntp，2mm?dtt，3％?dmso，0.02％吐溫20，余量為無核酸酶水。
17、上述緩沖液配置方法為：根據配置總量將各組分按比例稱量好后，全部溶解混勻后即配置完成，taq酶單獨分裝。
18、本專利技術還提供一種采用上述試劑盒同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr檢測方法，包括以采集樣本并提取核酸和以提取的核酸為模板進行實時熒光定量pcr反應并采集熒光，具體包括以下步驟：
19、s01：將樣本使用核酸提取試劑盒，使用核酸提取儀，按照如下提取程序將樣本提取成核酸備用；
20、
21、s02：將樣本提取模板、無rnase水(陰性對照)、陽性質控品(陽性對照)各5μl分別加入不同的pcr反應管中，并向各管中加入pcr引物探針緩沖液13.5μl、hot?start?taq酶1.5μl配成體系，蓋好管蓋，放入熒光定量pcr儀中進行熒光pcr檢測。
22、s03：設置儀器中的pcr擴增反應條件：50℃5分鐘-3.1℃/s；95℃2秒鐘-3.1℃/s；95℃1秒鐘-3.1℃/s，60℃10秒鐘-2.38℃/s并采集熒光，循環(huán)40次；
23、s04：步驟(3)反應完成后，基線設定為自動調整，根據擴增曲線圖和ct值對檢測結果進行分析；
24、s05：有效性判定：無rnase水檢測出的ct值為undet或40，且陽性質控品檢測出的ct值≤38，否則實驗視為無效；
25、s06：結果判讀：
26、樣本檢測孔ct值為undet或40，該樣本結果判斷為陰性，樣本dna/rna提取失敗、待測樣本中不含dna/rna或含量低于檢測限；
27、樣本檢測孔ct值≤38，該樣本結果判斷為對應的病原體陽性，樣本檢測成功；
28、樣本檢測孔ct值為38-40，需要復檢一次，如果ct值仍為38-40，則判斷為陰性。
29、本專利技術還提供了如上所述同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr試劑盒在咽拭子樣本和痰液樣本檢測本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR試劑盒，其特征在于，包括管1試劑和Tap酶；所述管1試劑包括PCR引物探針緩沖液、病原體引物探針、人DNA內參引物探針；其中，管1試劑內靶標為人鼻病毒、人腺病毒、人副流感病毒；
2.根據權利要求1所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述人鼻病毒的檢測探針序列5’端標記有FAM發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ1；所述人腺病毒的檢測探針序列5’端標記有ROX發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ2；所述人副流感病毒的檢測探針序列5’端標記有VIC發(fā)光基團，3’
3.根據權利要求1所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述人DNA內參的檢測探針序列5’端標記有CY5發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ2。
4.根據權利要求1所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述PCR引物探針緩沖液具體成分還包括：200mM?Tris-Hcl，30mM?Kcl，10m
5.一種采用如權利要求1-4任一項所述試劑盒同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR檢測方法，其特征在于，樣本包括鼻咽拭子樣本、鼻拭子樣本和痰液樣本。
7.一種如權利要求1-4任一項所述的同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重RT-PCR試劑盒在鼻咽拭子樣本、鼻拭子樣本和痰液樣本檢測中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr試劑盒，其特征在于，包括管1試劑和tap酶；所述管1試劑包括pcr引物探針緩沖液、病原體引物探針、人dna內參引物探針；其中，管1試劑內靶標為人鼻病毒、人腺病毒、人副流感病毒；
2.根據權利要求1所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr試劑盒，其特征在于，所述人鼻病毒的檢測探針序列5’端標記有fam發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq1；所述人腺病毒的檢測探針序列5’端標記有rox發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2；所述人副流感病毒的檢測探針序列5’端標記有vic發(fā)光基團，3’
3.根據權利要求1所述的一種同時檢測引起急性鼻炎的3種病原體的多重rt-pcr試劑盒，其特征在于，所述人dna內參的檢測探針序列5’端標記有cy5發(fā)光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2。...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：董曉艷，史芊，閆泉，甄博文，王瑩，梁寧孝，王洪，戴海峰，高凡，郭曉璐，
申請(專利權)人：愛科睿特生物醫(yī)療科技南京有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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