【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于法醫學檢測，具體涉及一種基于組織特異性cpg標記進行體液鑒定的試劑盒、引物組合及方法，特別涉及利用dna甲基化敏感型限制性內切酶hha?i對待測樣本dna進行酶切，然后基于體液特異性差異甲基化標記(cpg)進行體液來源鑒定的檢測方法。
技術介紹
1、在法醫學鑒定中體液斑是常見的生物證據。識別體液的組織來源可以在生物證據和犯罪之間建立聯系。目前依賴于通過化學、催化和免疫學分析或直接觀察特定細胞來鑒定體液類型，psa是確證精液斑的理想檢材，α-淀粉酶活性是大多數唾液鑒定方法的指標，基于魯米諾試驗進行外周血鑒定等。然而，這些方法的靈敏度低，且生物檢材在環境中容易降解，容易出現假陽性或假陰性結果，這限制了它們的應用。最近開發了使用mrna和mirna的體液鑒定方法，rna具有較強的體液特異性及多重分析能力，但是，我們見到的生物檢材大多長期暴露在惡劣的環境下，又因為rna極不穩定，所以限制了其在日常法醫工作中的應用。還可以利用微生物來進行體液識別，但是關于微生物標志物識別混合體液樣本的來源的研究較少，混合樣品含有兩種以上體液的微生物群落，這使得鑒定更加困難。隨著表觀遺傳學的發展，dna甲基化慢慢成為了法醫體液鑒定的熱點，在表觀遺傳修飾在轉錄調控中起著至關重要的作用。目前已經有很多研究利用體液特異性dna甲基化標記進行體液來源鑒定。分析方法主要有亞硫酸氫鹽轉化法，但該方法會導致dna降解的不良副作用。以及甲基化敏感型限制性內切酶(msre)消化法，該方法可以消化酶識別序列中的未甲基化cpg位點，而甲基化的cpg位點抵抗消化。甲
2、本專利技術首先使用dna甲基化敏感型限制性內切酶(msre)進行dna酶切，然后對組織特異性cpg標記進行復合擴增，基于毛細管電泳平臺，建立了一種同時進行五種體液(精液、唾液、外周血、陰道分泌物和月經血)鑒定的檢測方法。并且，法醫學鑒定的最終目的是進行個體識別，該方法還可以結合商業化str試劑盒人類strtyper-21g擴增熒光檢測試劑盒(plus)進行共檢測，將體液與供者緊密聯系起來。
技術實現思路
1、本專利技術為了解決目前體液鑒定方法存在的鑒定困難的問題，提供了一種基于組織特異性cpg標記進行體液鑒定的試劑盒、引物組合及方法。
2、專利技術人選擇組織特異性cpg標記。選擇標準：(1)靶體液與其他體液有甲基化差異：在靶體液是甲基化的，在其他體液幾乎未甲基化；(2)不同個體的相同體液的甲基化水平具有較小的差異(在人群中的個體差異＜0.2)；(3)甲基化位點是hha?i的酶切序列(5’-gcgc-3’)或甲基化位點附近300bp內存在hha?i的酶切序列(設計引物時擴增子應包含該序列)。(4)cpg標記(cg27322556)在任何組織種均無甲基化且含有hha?i的酶切序列，我們將該段序列作為dc來評估酶切效率。管家基因actb(nc_000007.14)該段序列中不包含hha?i的酶切序列，我們將其作為pc來評估pcr的擴增效率。
3、表1?7個標記的相關信息
4、
5、注：se代表精液、sa代表唾液、pb代表外周血、vg代表陰道分泌物、mb代表月經血。
6、本專利技術是通過以下技術方案實現的：基于組織特異性cpg進行體液鑒定的試劑盒，包括seq?id?no.1～14所示的7對特異性多重pcr引物，分別是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、actb、cg27322556。
7、作為本專利技術試劑盒技術方案的進一步改進，所述特異性多重pcr引物中，cg05261336的特異性pcr引物為seq?id?no.1的上游引物和seq?id?no.2的下游引物；
8、cg09107912的特異性pcr引物為seq?id?no.3的上游引物和seq?id?no.4的下游引物；
9、cg04011671的特異性pcr引物為seq?id?no.5的上游引物和seq?id?no.6的下游引物；
10、cg15988970的特異性pcr引物為seq?id?no.7的上游引物和seq?id?no.8的下游引物；
11、cg18069290的特異性pcr引物為seq?id?no.9的上游引物和seq?id?no.10的下游引物；
12、actb的特異性pcr引物為seq?id?no.11的上游引物和seq?id?no.12的下游引物；
13、cg27322556的特異性pcr引物為seq?id?no.13的上游引物和seq?id?no.14的下游引物。
14、作為本專利技術試劑盒技術方案的進一步改進，所述特異性多重pcr引物分別用于檢測以下7個標記，分別是：1個精液特異性cpg標記、1個唾液特異性cpg標記、1個外周血特異性cpg標記、1個陰道分泌物特異性cpg標記、1個月經血特異性cpg標記、1個評估pcr擴增效果的管家基因actb以及1個評估酶切效果的cpg標記。
15、作為本專利技術試劑盒技術方案的進一步改進，所述試劑盒還包括用于檢測pcr產物的去離子甲酰胺和分子量內標size-500plus。
16、本專利技術進一步提供了基于組織特異性cpg進行體液鑒定的試劑盒在體液成分鑒定中的應用。
17、作為本專利技術應用技術方案的進一步改進，所述體液為精液、唾液、外周血、陰道分泌物和月經血一種或多種。
18、本專利技術還提供了一種基于組織特異性cpg進行體液鑒定的引物組合，包括seq?idno.1～14所示的7對特異性多重pcr引物，分別是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、actb、cg27322556。
19、本專利技術更進一步提供了一種基于組織特異性cpg進行體液來源檢測的方法，包括以下步驟：
20、1)提取待測樣本dna，使用dna甲基化敏感型限制性內切酶hha?i對待測樣本的dna進行酶切作為之后擴增的模板；
21、2)利用所述seq?id?no.1～14所示的7對pcr引物，通過多重特異性pcr得到擴增產物；
22、3)通過3500dna測序儀對產物進行檢測，通過genemapper?id?v3.2對其進行分析。
23、本專利技術提供的技術方案與現有技術相比具有如下優點：
24、與現有技術相比，本專利技術具有以下優勢：
25、1)本專利技術所述試劑盒基于dna甲基化敏感型限制性內切酶對待測樣本的dna進行酶切，然后進行多重pcr擴增，快速，簡便；
26、2)本專利技術所述試劑盒基于毛細管電泳平臺，該平臺在基層法醫中較為常用，該技術簡便易行，成本較低，便于在基層普及；
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【技術保護點】
1.基于組織特異性CpG進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，包括SEQ?ID?NO.1～14所示的7對特異性多重PCR引物，分別是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、ACTB、cg27322556。
2.?根據權利要求1所述的基于組織特異性CpG進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，所述特異性多重PCR引物中，cg05261336的特異性PCR引物為SEQ?ID?NO.1的上游引物和SEQID?NO.2的下游引物；
3.根據權利要求1所述的基于組織特異性CpG進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，所述特異性多重PCR引物分別用于檢測以下7個標記，分別是：1個精液特異性CpG標記、1個唾液特異性CpG標記、1個外周血特異性CpG標記、1個陰道分泌物特異性CpG標記、1個月經血特異性CpG標記、1個評估PCR擴增效果的管家基因ACTB以及1個評估酶切效果的CpG標記。
4.根據權利要求1所述的基于組織特異性CpG進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于檢測PCR產物的去離
5.權利要求1至4任一權利要求所述基于組織特異性CpG進行體液鑒定的試劑盒在體液成分鑒定中的應用。
6.如權利要求5所述應用，其特征在于，所述體液為精液、唾液、外周血、陰道分泌物和月經血一種或多種。
7.一種基于組織特異性CpG進行體液鑒定的引物組合，其特征在于，包括SEQ?ID?NO.1～14所示的7對特異性多重PCR引物，分別是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、ACTB、cg27322556。
8.一種基于組織特異性CpG進行體液來源檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.基于組織特異性cpg進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，包括seq?id?no.1～14所示的7對特異性多重pcr引物，分別是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、actb、cg27322556。
2.?根據權利要求1所述的基于組織特異性cpg進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，所述特異性多重pcr引物中，cg05261336的特異性pcr引物為seq?id?no.1的上游引物和seqid?no.2的下游引物；
3.根據權利要求1所述的基于組織特異性cpg進行體液鑒定的試劑盒，其特征在于，所述特異性多重pcr引物分別用于檢測以下7個標記，分別是：1個精液特異性cpg標記、1個唾液特異性cpg標記、1個外周血特異性cpg標記、1個陰道分泌物特異性cpg標記、1個月經血特異性cpg標記、1個評估pcr擴增效果的管家基因ac...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李澤琴，原芳，張更謙，嚴江偉，王佳琦，劉紫東，李麗珊，
申請(專利權)人：山西醫科大學，
類型：發明
國別省市：
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