【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于外來入侵螞蟻檢測的，具體涉及一種引物組、其應用及用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法。
技術介紹
1、外來入侵物種（invasive?alien?species,?ias）是造成生物多樣性喪失的主要原因，對生態系統的危害持續存在。外來入侵螞蟻（invasive?alien?ant,?iaa）是世界上最具侵略性、最具競爭力和分布最廣的外來物種之一。小火蟻 wasmannia?auropunctata(roger,1863)，也被稱為“電蟻”，已被無意中傳播至世界各地。在其定殖區域內，小火蟻可減少本地螞蟻和其他無脊椎動物的生物多樣性，影響脊椎動物（如陸龜和鳥類）的繁殖力，并對人類造成不可忽視的健康危害。小火蟻的毒刺可引起過敏人群的過敏性休克反應，并傷害家畜（如貓和狗）。這種雜食性外來物種之所以能夠在世界范圍內迅速擴張，很大程度上是因為它能夠在多樣化的棲息地中定居，并能忍受各種氣候和環境條件。
2、目前，針對小火蟻的檢疫鑒定，主要采用形態學鑒定以及條形碼鑒定技術。傳統的形態學鑒定技術，嚴重依賴檢測人員的技術背景和工作經驗，且常準確度不高，耗時耗力。而條形碼技術依賴基因組特征，對特定基因片段（如coi基因等）進行擴增、測序以及序列分析，得出的結論相對形態學技術更為可靠，但檢測過程復雜、依賴復雜的儀器（如pcr儀和測序儀等），檢測周期長，工作效率低。故提供一種特異性強、靈敏度更高的鑒定方法是技術工作者亟待解決的問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種引物組、其應用及用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法。通過實施該檢測方法用于鑒定小火蟻樣本具備特異性強、靈敏度高、準確性高、操作簡便、檢測時長短的優點。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種引物組，由上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5組成。
4、上游引物1-wa1-f7的核苷酸序列為：
5、aagctaatacgactcactatagggtcatctagtgagaaattccttcatcctc。
6、下游引物1-wa1-r2的核苷酸序列為：
7、ctggttaatgcgaaagctttgttgtttt。
8、rna引物1-wa1-rna5的核苷酸序列為：
9、fam-gagagagagagcacgcuuuauauuaaau-bhq1。
10、本專利技術還提供了上述引物組的應用，應用具體為如下（1）或（2）：
11、（1）檢測樣本中是否含有小火蟻；
12、（2）用于制備檢測樣本中是否含有小火蟻的試劑盒。
13、本專利技術還提供了一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，該方法包括如下步驟：
14、s01、供試蟲樣的選擇：
15、選取實驗蟲樣包括小火蟻6頭和其他近似蟲樣6頭，共12頭。
16、s02、引物及探針的設計合成：
17、根據genbank公布的小火蟻序列，選取得到特異性靶標序列waur-275；
18、經合成，得到初輪上游引物序列seq?id?no.1~?seq?id?no.8；
19、初輪下游引物序列seq?id?no.9~?seq?id?no.16；
20、rna引物序列seq?id?no.17~?seq?id?no.24；
21、s03、檢測樣本dna提取
22、取0.1-0.5?mg的蟲樣置于1.5?ml無菌離心管中，用一次性組織研磨杵搗碎，按照us?everbright基因組dna小量制備試劑盒操作說明逐步提取，提取后的dna經超微量分光光度計檢測濃度后，保存于-20℃冰箱備用。
23、s04、rna引物篩選
24、使用基礎熒光恒溫擴增檢測試劑盒進行實驗，反應體系20?μl：dna上游引物0.5?μl，dna下游引物0.5?μl，rna引物0.2?μl，1.8?μl無酶蒸餾水，擴增模板5?μl，基礎熒光恒溫擴增檢測試劑盒中的激活液12?μl，基礎熒光恒溫擴增檢測試劑盒中的干粉一管；
25、在含有基礎干粉的八連管中加入濃度為20?μmol/l的上游引物、下游引物各0.5?μl，250?ng/μl的rna引物0.2?μl，1.8?μl無酶蒸餾水，共3?μl，瞬時離心；
26、離心后沿八連管壁中下部加入5?μl?dna，瞬時離心，室溫靜置2?min；沿八連管管壁中下部加12?μl激活液，蓋上蓋子，震蕩混勻10?s，瞬時離心后上機檢測；
27、熒光定量pcr儀溫度設置為42℃，1?min進行一個循環，每個循環進行一次信號采集，報告基團設置為fam；配制完成后在實時熒光pcr儀進行實時檢測；
28、將對應的引物組進行對比，選擇ct值最小且終點熒光值最高的組合確定rna引物，再根據rna引物對應的4組dna引物結果，根據ct值的大小及終點熒光值的高低進行選擇，選取ct值相對較小和終點熒光值相對較高的組別，若無法比較則率先選擇ct值最小的，最終確定rna引物定為1-wa1-rna5；
29、實驗分為實驗組和空白對照組；
30、其中，實驗組為以2號小火蟻的dna作為擴增模板，濃度為5.2?ng/μl，空白對照組為以水作為擴增模板。
31、s05、dna下游引物篩選
32、rna引物定為1-wa1-rna5，dna上游引物定為1-wa1-f4，dna下游引物分別可選自1-wa1-r1、1-wa1-r2、1-wa1-r3、1-wa1-r5、1-wa1-r6、1-wa1-r7和1-wa1-r8中的一種；
33、參照s04步驟中的反應體系與條件，通過反應篩選得到ct值較低的dna下游引物為1-wa1-r2；
34、s06、dna上游引物篩選
35、rna引物定為1-wa1-rna5，dna下游引物定為1-wa1-r2，分別以1-wa1-f1、1-wa1-f2、1-wa1-f3、1-wa1-f4、1-wa1-f6、1-wa1-f7和1-wa1-f8作為dna上游引物進行實驗，參照s04步驟中的反應體系與條件，篩選得到ct值較低的dna上游引物1-wa1-f7；
36、s07、經驗證篩選得出所述的上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5；
37、s08、通過混合上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5、按照s04中的反應體系以及反應程序進行試驗，從而確定檢測結果。
38、上機后溶劑內熒光產生步驟主要分為三步進行，分別為dna擴增、dna轉錄為rna、rna引物水解產生信號。dna擴增步驟：重組酶與dna引物結合，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種引物組，其特征在于，由上游引物1-WA1-F7、下游引物1-WA1-R2和RNA引物1-WA1-RNA5組成；
2.引物組的應用，其特征在于，為如下(1)或(2)：
3.一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，其特征在于，包括如下步驟：
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟S04中，基礎干粉由DNA重組酶、蝦堿性磷酸酶、T7?RNA聚合酶、逆轉錄酶和信號放大酶的凍干產物及凍干保護劑組成。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟S04中，激活液由核苷三磷酸和緩沖液組成，緩沖液由氯化鎂、Tris-HCl和氯化鉀及無酶超純水配置而成。
6.根據權利要求3所述的一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，其特征在于，在步驟S03中，RNA引物篩選的步驟為：
7.根據權利要求6所述的一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，其特征在于，DNA下游引物篩選的步驟為：
8.根據權利要求3所述的一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，其特征在于，DNA上游引
...【技術特征摘要】
1.一種引物組，其特征在于，由上游引物1-wa1-f7、下游引物1-wa1-r2和rna引物1-wa1-rna5組成；
2.引物組的應用，其特征在于，為如下(1)或(2)：
3.一種用于檢測樣本外來入侵螞蟻是否為小火蟻的方法，其特征在于，包括如下步驟：
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟s04中，基礎干粉由dna重組酶、蝦堿性磷酸酶、t7?rna聚合酶、逆轉錄酶和信號放大酶的凍干產物及凍干保護劑組成。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王佳瑩，崔俊霞，段維軍，劉麗，顏書怡，李文，王媛婧，王路歌，
申請(專利權)人：寧波海關技術中心，
類型：發明
國別省市：
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