【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程和遺傳工程，具體涉及一種催化降解纖維素底物活力提高的雙功能纖維素酶突變體及其應用。
技術介紹
1、纖維素乙醇是以不可食用部分的木質纖維素，包括農作物秸稈、甘蔗渣等為原料產生的生物燃料，是最早提出的可再生能源發展策略，具有綠色低碳、可持續發展的優點。據估算，如果5%的木質纖維中所含的生物質能得到有效的開發利用，人類的能源危機就能得到有效的緩解。因此，如何將農作物秸稈轉化成燃料乙醇是近年來研究的熱點。
2、以秸稈為原料的二代纖維素乙醇技術的突破，則是生物質能產業的發展重點。但是，由于秸稈中的纖維素和半纖維素相互交聯在一起，具有同時降解纖維素和半纖維素能力的多功能酶，不僅可以保證纖維素乙醇生產，還可以產出高附加值的低聚寡糖產品，與目前市場上的單功能酶復合劑相比，在簡化工藝降低成本方面具有非常大的意義和不可估量的工業應用價值。
3、截至目前，研究人員利用各種策略嘗試獲得高催化活性的耐熱多功能纖維素酶。除了大量篩選以獲得多功能天然酶外，利用蛋白質工程手段對酶分子進行改良也是酶工程領域的研究熱點。但是，相對于單功能酶，多功能酶催化活性的改造存在著更大的挑戰。
4、基于結構的理性設計可以有效的幫助我們對多功能纖維素酶進行活力的優化。酶催化過程離不開無規則卷曲（即loop）區的運動。loop的運動可以使得活性位點靠近底物并加速其催化，對未知功能loop區的研究以及合理地優化，不僅有助于酶性能的改良，更可以探究loop區對酶催化功能的影響機制。
技術實現思路b>
1、本專利技術的目的在于提供一種催化效率提高的纖維素酶突變體及其應用。
2、一種催化效率提高的纖維素酶突變體，所述纖維素酶突變體的氨基酸序列如序列表seq?id?no：3所示，核酸序列如序列表seq?id?no：4所示。
3、所述纖維素酶突變體是通過定點突變野生型纖維素酶65位點的qln為leu得到。
4、所述底物特異性改變的纖維素酶突變體的野生型（突變前）氨基酸序列如seq?idno：1所示。
5、所述底物特異性改變的纖維素酶突變體的野生型（突變前）核酸序列如seq?idno：2所示。
6、包含所述雙功能纖維素酶突變體基因的載體。
7、包含所述雙功能纖維素酶突變體基因載體的工程菌。
8、擴增所述雙功能纖維素酶突變體基因的引物。
9、一種制備纖維素酶突變的方法，按照如下步驟進行：
10、1）將纖維素酶野生型序列片段克隆到表達載體ppic-9k上，重組載體命名 ppic9k- hwcel5a；
11、2）以重組載體 ppic9k-hwcel5a為模板，通過攜帶突變位點的引物對其進行擴增，獲得攜帶突變體序列的重組載體，命名為 ppic9k-hwcel5a-q65l；
12、3）將突變體重組載體轉化畢赤酵母gs115，誘導表達，獲得突變株gs115 /hwcel5a-q65l。
13、所述攜帶突變位點的引物如序列表seq?id?no：5、seq?id?no：6所示。
14、所述催化效率提高的纖維素酶突變體在降解纖維素底物羧甲基纖維素鈉方面的應用。
15、本專利技術的有益效果：本專利技術通過對纖維素酶突變體的野生型q65位點實施定點突變獲得q65l突變體，將突變體重組載體轉化畢赤酵母gs115，通過對小管水平的發酵液進行酶活測定初步篩選陽性轉化子。對酶活最高的轉化子進行大瓶誘導，并對粗酶液進行蛋白濃縮及純化。利用sds-page電泳檢測純化后突變體和野生型的純度。以純化后的蛋白為對象，利用dns法測定野生型與突變體的基本酶學性質。結果表明，酶促反應的最適ph值不發生改變，突變體的最適溫度提高至80℃，突變體的纖維素酶比活力比野生型提高了63%。本專利技術證明并確認了所提供的纖維素酶突變體，對于研究材料 hwcel5a的loop改良提供了重要的線索，同時對該家族的其他纖維素酶的改良提供了參考。本專利技術結合酶的晶體學結構基礎與動力學模擬技術，通過分析多功能纖維素酶loop區結合底物的運動軌跡，對纖維素酶的活性進行了改造，改造后的突變體降解纖維素底物羧甲基纖維素鈉的能力提高了67%。
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1.一種催化效率提高的纖維素酶突變體，其特征在于，所述纖維素酶突變體的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：3所示，核酸序列如序列表SEQ?ID?NO：4所示。
2.根據權利要求1所述催化效率提高的纖維素酶突變體，其特征在于，纖維素酶突變體是通過定點突變野生型纖維素酶65位點的Qln為Leu得到。
3.包含權利要求1所述雙功能纖維素酶突變體基因的載體。
4.包含權利要求3所述雙功能纖維素酶突變體基因載體的工程菌。
5.擴增權利要求1所述雙功能纖維素酶突變體基因的引物。
6.一種制備權利要求1所述纖維素酶突變的方法，其特征在于，按照如下步驟進行：
7.根據權利要求6所述制備纖維素酶突變的方法，其特征在于，所述攜帶突變位點的引物如序列表SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6所示。
8.權利要求1所述催化效率提高的纖維素酶突變體在降解纖維素底物羧甲基纖維素鈉方面的應用。
【技術特征摘要】
1.一種催化效率提高的纖維素酶突變體，其特征在于，所述纖維素酶突變體的氨基酸序列如序列表seq?id?no：3所示，核酸序列如序列表seq?id?no：4所示。
2.根據權利要求1所述催化效率提高的纖維素酶突變體，其特征在于，纖維素酶突變體是通過定點突變野生型纖維素酶65位點的qln為leu得到。
3.包含權利要求1所述雙功能纖維素酶突變體基因的載體。
4.包含權利要求3所述雙功能纖維素酶突變體...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭潔，
申請(專利權)人：北京市科學技術研究院，
類型：發明
國別省市：
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