【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，是一種基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法。
技術(shù)介紹
1、dna測序技術(shù)是分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù)，它的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了生物學(xué)的發(fā)展。高通量dna測序技術(shù)基因測序?qū)鹘y(tǒng)測序技術(shù)的一次革命性提高、生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)衛(wèi)生領(lǐng)域中的最為重要的關(guān)鍵核心技術(shù)之一。它一次運(yùn)行能同時(shí)對幾百萬甚至幾千萬條dna序列進(jìn)行測序，使得測序成本下降了上萬倍，效率提高了數(shù)千倍，成為生物
發(fā)展最快、影響最大、競爭最為激烈的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。雖然pacific?biosciences公司和smrt測序儀和牛津納米孔公司納米孔測序儀超長的測序長度，使其在單倍型分析等特定領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但其較高測序錯(cuò)誤率使其應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。目前主流的高通量測序平臺是illumina公司的二代solexa測序合成技術(shù)，它具有最高的測序通量(1t)，相對較長的測序長度(300bp)和自動(dòng)化程度高的操作。然而，即使目前主流的高通量dna測序平臺仍然存在著較大的錯(cuò)誤率以及測序長度有限的問題。高錯(cuò)誤率使得檢測單核苷酸多態(tài)性(snp)或低豐度突變極其困難，限制了高通量dna測序平臺的臨床應(yīng)用，例如主要基于snp的藥物基因組學(xué)研究和主要基于低豐度突變的早期臨床診斷；而有限的測序長度限制了單倍型、短串聯(lián)重復(fù)序列(str)等方面的實(shí)際應(yīng)用。
2、申請人提出過標(biāo)記非封閉兩核苷酸的兩核苷酸同時(shí)合成dna測序方法及其應(yīng)用(cn102329884a)，該方法通過兩輪測序解碼測序信息得到鍵繼續(xù)了信息，大幅度提升了測序長度、且與熒光固定在測序引物上的高通量測序平臺
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本專利技術(shù)提供了一種基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，該方法可以提高序列測定的長度及準(zhǔn)確度，從而實(shí)現(xiàn)待測核酸序列的高通量檢測。
2、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供一種基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，包括如下步驟：
3、單個(gè)合成測序反應(yīng)由按照一定比例的一種天然核苷酸x、標(biāo)記的3’端非封閉的相同核苷酸x’，及另一種3’端可逆封閉核苷酸y*、標(biāo)記的3’端可逆封閉相同核苷酸y*’完成；
4、測序循環(huán)可以依據(jù)兩色標(biāo)記或者四色標(biāo)記模式實(shí)施：
5、在四色標(biāo)記模式中，按照a、c、g、t四種核苷酸在一個(gè)循環(huán)中使用、且只使用一次的方式，一個(gè)測序循環(huán)包括依次連續(xù)進(jìn)行的兩個(gè){(x+x’1)+(y*+y*’2)}、{(w+w’3)+(z*+z*’4)}合成反應(yīng)；然后成像，記錄四色標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息；再通過切割標(biāo)記物、3’端封閉基團(tuán)脫保護(hù)后、進(jìn)行下一個(gè)測序循環(huán)測序；經(jīng)過若干個(gè)測序反應(yīng)后得到待測dna模板的堿基序列信息；
6、在兩色標(biāo)記模式中，按照a、c、g、t四種核苷酸在一個(gè)循環(huán)中使用、且只使用一次的方式，一個(gè)測序循環(huán)包括兩個(gè)獨(dú)立的{(x+x’1)+(y*+y*’1)}、{(w+w’2)+(z*+z*’2)}合成測序反應(yīng)：如第一個(gè)測序反應(yīng)進(jìn)行{(a+a’1)+(c*+c*1)}后，洗滌未反應(yīng)的試劑；然后進(jìn)行第二個(gè)測序反應(yīng){(t+t’2)+(g*+g*’2)}；然后成像，記錄兩色標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息；再通過切割標(biāo)記物、3’端封閉基團(tuán)脫保護(hù)后，進(jìn)行下一個(gè)測序循環(huán)測序；經(jīng)過若干個(gè)測序反應(yīng)后得到待測dna模板的堿基序列信息。
7、其中的1，2，3，4代表四種不同熒光基團(tuán)，數(shù)字相同則代表標(biāo)記的熒光基團(tuán)相同，數(shù)字不同則表示標(biāo)記的熒光基團(tuán)不同。
8、其中，所述天然核苷酸x、3’端可逆封閉核苷酸y*、3’端非封閉的相同核苷酸x’、3’端可逆封閉核苷酸y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例為x:x’＝1:1-20；y*:y*’＝0-1:1-10。本專利技術(shù)中采用的是x:x’＝1:20；y*:y*’＝1:10。
9、作為優(yōu)選，所述天然核苷酸x、3’端可逆封閉核苷酸y*、3’端非封閉的相同核苷酸x’、3’端可逆封閉核苷酸y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例優(yōu)選為x:x’＝1：1～5；y*:y*＝0～1：1～2。
10、其中，所述標(biāo)記的3’端非封閉的核苷酸x’，其標(biāo)記物標(biāo)記在堿基位置，且標(biāo)記物熒光基團(tuán)在合適的反應(yīng)條件下可以被切割掉。
11、其中，所述3’端可逆封閉標(biāo)記的核苷酸y*的標(biāo)記方式除標(biāo)記物不同外，與天然核苷酸x’標(biāo)記、切割方式均相同；其3’端羥基是被包括3’-o-烯丙基、3’-o-氰乙基、3’-o-疊氮甲基或者3’-o-氨基等基團(tuán)封閉，所述3’端可逆封閉標(biāo)記的核苷酸y*能夠參與合成測序反應(yīng)、且最多只能發(fā)生一個(gè)核苷酸的合成，3’端封閉基團(tuán)在合適的反應(yīng)條件下可以被脫出、并活化出核苷酸的3’端羥基，最佳反應(yīng)條件下與標(biāo)記物的切割條件完全一致、并與切割合并實(shí)施。
12、其中，所述標(biāo)記物的激發(fā)波長是相互不干擾的，其熒光強(qiáng)度在經(jīng)過待測dna模板量的歸一化后、通過實(shí)驗(yàn)確定與其核苷酸合成數(shù)目的數(shù)學(xué)關(guān)系。即根據(jù)熒光強(qiáng)度可以判斷核苷酸數(shù)目。
13、其中，所述四色標(biāo)記模式中標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息是依據(jù)下列方式確定的：標(biāo)記物1、2、3、4(分別對應(yīng)第一個(gè)反應(yīng)的x’、y*和第二個(gè)反應(yīng)的w’、z*)得到的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息分別為m、q、n、p；當(dāng)q＝1、m＝n＝p＝0時(shí)，表明只有第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了一個(gè)堿基y的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n＝p＝0時(shí)，表明只有第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基x的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n＝0、p＝1時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基x的合成，第二個(gè)反應(yīng)發(fā)生了一個(gè)堿基z的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n≧1、p＝0時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基x的合成，第二個(gè)反應(yīng)發(fā)生了n個(gè)堿基w的合成，其堿基序列排布為m個(gè)堿基x、再n個(gè)堿基w；當(dāng)q＝0、m≧1、n≧1、p＝1時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基x的合成，第二個(gè)反應(yīng)除發(fā)生了n個(gè)堿基w的合成、還發(fā)生了一個(gè)堿基z的合成，其堿基序列排布為連續(xù)m個(gè)堿基x、再n個(gè)堿基w、最后一個(gè)堿基z。
14、其中，所述兩色標(biāo)記模式中標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息是依據(jù)下列方式確定的：在兩色標(biāo)記模式中標(biāo)記物1、2得到的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息分別為m、n(1、2的熒光強(qiáng)度與合成數(shù)目具有線性關(guān)系)；當(dāng)n＝0時(shí)，則發(fā)生了(m-1)個(gè)x和一個(gè)y的延伸，(由于y的封閉本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述天然核苷酸X、3’端可逆封閉核苷酸Y*、3’端非封閉的相同核苷酸X’、3’端可逆封閉核苷酸Y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例為X:X’＝1:1～20，Y*:Y*’＝0～1:1～10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述天然核苷酸X、3’端可逆封閉核苷酸Y*、3’端非封閉的相同核苷酸X’、3’端可逆封閉核苷酸Y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例優(yōu)選為X:X’＝1：1～5；Y*:Y*＝0～1：1～2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述標(biāo)記的3’端非封閉的核苷酸X’，其標(biāo)記物標(biāo)記在堿基位置，且標(biāo)記物熒光染料在合適的反應(yīng)條件下可以被切割掉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述3’端可逆封閉標(biāo)記的核苷酸Y*的標(biāo)記方式除標(biāo)記物不同外，與天然核苷酸X’標(biāo)記、切割方
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述標(biāo)記物的激發(fā)波長是相互不干擾的，其熒光強(qiáng)度在經(jīng)過待測DNA模板量的歸一化后、通過實(shí)驗(yàn)確定與其核苷酸合成數(shù)目的數(shù)學(xué)關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述四色標(biāo)記模式中標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息是依據(jù)下列方式確定的：標(biāo)記物1、2、3、4得到的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息分別為m、q、n、p；當(dāng)q＝1、m＝n＝p＝0時(shí)，表明只有第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了一個(gè)堿基Y的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n＝p＝0時(shí)，表明只有第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基X的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n＝0、p＝1時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基X的合成，第二個(gè)反應(yīng)發(fā)生了一個(gè)堿基Z的合成；當(dāng)q＝0、m≧1、n≧1、p＝0時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基X的合成，第二個(gè)反應(yīng)發(fā)生了n個(gè)堿基W的合成，其堿基序列排布為m個(gè)堿基X、再n個(gè)堿基W；當(dāng)q＝0、m≧1、n≧1、p＝1時(shí)，表明第一個(gè)反應(yīng)發(fā)生了m個(gè)堿基X的合成，第二個(gè)反應(yīng)除發(fā)生了n個(gè)堿基W的合成、還發(fā)生了一個(gè)堿基Z的合成，其堿基序列排布為連續(xù)m個(gè)堿基X、再n個(gè)堿基W、最后一個(gè)堿基Z；所述兩色標(biāo)記模式中標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息是依據(jù)下列方式確定的：在兩色標(biāo)記模式中標(biāo)記物1、2得到的熒光強(qiáng)度、并轉(zhuǎn)換成堿基序列信息分別為m、n；當(dāng)n＝0時(shí)，則發(fā)生了(m-1)個(gè)X和一個(gè)Y的延伸，沒有發(fā)生W和Z的延伸；n≧1時(shí)，則發(fā)生了m個(gè)X的延伸、沒有發(fā)生Y的延伸；發(fā)生了(n-1)個(gè)W和一個(gè)不能確定的記為編碼(WZ)的延伸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，具體包括如下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述待測DNA模板片段是指單分子，或者以單分子為模板擴(kuò)增的相同序列產(chǎn)物；待測DNA模板包括一種序列或者不同DNA模板的陣列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述待測DNA模板可以進(jìn)行一輪測序，也可以兩輪不同組合的兩類不同核苷酸合成測序，以提高測序信息的準(zhǔn)確度。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述天然核苷酸x、3’端可逆封閉核苷酸y*、3’端非封閉的相同核苷酸x’、3’端可逆封閉核苷酸y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例為x:x’＝1:1～20，y*:y*’＝0～1:1～10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述天然核苷酸x、3’端可逆封閉核苷酸y*、3’端非封閉的相同核苷酸x’、3’端可逆封閉核苷酸y*’參與單個(gè)合成測序反應(yīng)的摩爾比例優(yōu)選為x:x’＝1：1～5；y*:y*＝0～1：1～2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述標(biāo)記的3’端非封閉的核苷酸x’，其標(biāo)記物標(biāo)記在堿基位置，且標(biāo)記物熒光染料在合適的反應(yīng)條件下可以被切割掉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述3’端可逆封閉標(biāo)記的核苷酸y*的標(biāo)記方式除標(biāo)記物不同外，與天然核苷酸x’標(biāo)記、切割方式均相同；其3’端羥基是被包括3’-o-烯丙基、3’-o-氰乙基、3’-o-疊氮甲基或者3’-o-氨基封閉，所述3’端可逆封閉標(biāo)記的核苷酸y*能夠參與合成測序反應(yīng)、且最多只能發(fā)生一個(gè)核苷酸的合成，3’端封閉基團(tuán)在合適的反應(yīng)條件下可以被脫出、并活化出核苷酸的3’端羥基，最佳反應(yīng)條件下與標(biāo)記物的切割條件完全一致、并與切割合并實(shí)施。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，其特征在于，所述標(biāo)記物的激發(fā)波長是相互不干擾的，其熒光強(qiáng)度在經(jīng)過待測dna模板量的歸一化后、通過實(shí)驗(yàn)確定與其核苷酸合成數(shù)目的數(shù)學(xué)關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于標(biāo)記的兩類不同核苷酸合成測序方法，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：成楚，肖鵬峰，章志凌，葉靜斯，
申請(專利權(quán))人：東南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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