【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫細胞治療領域，具體涉及修飾的巨噬細胞，其制備方法與應用。
技術介紹
1、過繼性細胞療法是腫瘤免疫治療策略中的主要手段之一，其原理為：運用體外細胞因子處理、基因編輯等技術對人免疫細胞進行體外修飾、激活與擴增，使其成為能高效識別腫瘤細胞的殺傷型免疫細胞，這類免疫細胞回輸患者后，可達到治療并控制腫瘤的目的。目前，臨床以嵌合抗原受體t細胞(chimeric?antigen?receptor?t-cell?immunotherapy，car-t)療法作為治療淋巴系血液腫瘤的主要手段。然而在臨床上，car-t對實體瘤治療效果甚微，相關原因主要有三方面：(1)缺少合適的癌細胞靶抗原：實體瘤異質性較強，單一靶點的car-t無法達到高效靶向的效應；(2)實體瘤微環境復雜度高：其微環境具有纖維結締組織增生、低氧、免疫抑制及血管畸形等諸多特點，這些因素皆構成了阻礙治療型免疫細胞進入并生存的物理、化學及免疫屏障，使得細胞治療難以發揮理想的抑瘤功能，甚至難以存活；(3)car-t細胞釋放的多種細胞因子誘導的細胞因子釋放綜合征(crs)也對實際應用提出了挑戰。
2、巨噬細胞是一種源自單核細胞的免疫細胞，存在于身體的幾乎每個組織中，在體內參與了包括從發育到骨骼重塑和傷口愈合等大量的生物過程。巨噬細胞的主要功能是對體液和組織中的病原體及細胞碎片進行吞噬消化，同時，還可以通過抗原呈遞，招募t細胞并分泌細胞因子，來啟動和增強適應性免疫反應。由于巨噬細胞強大和多樣的功能，其在體內受到嚴格調控，同時，存在促炎和抗炎兩種截然相反的狀態。“經
3、car-巨噬細胞(car-m)技術是將car和巨噬細胞結合(car-m)，以刺激巨噬細胞產生靶向抗腫瘤效果，并刺激適應性免疫應答。目前car-m的設計，主要繼承于car-t細胞的設計原則，包括car-t的一些經典的組成部分。
4、人外周血單核細胞(pbmc)是巨噬細胞的最廣泛來源。然而，由于巨噬細胞在體外或體內注射后不會增殖，患者只能接受有限數量的巨噬細胞進行重塑和過繼性細胞治療。實體瘤對患者的損耗隨著腫瘤的進展加劇，其中巨噬細胞又常因放化療、靶向制劑的應用而耗竭。pbmc來源的巨噬細胞無論在活性及數量上都難以支持car-m的應用。適用于臨床的巨噬細胞的可靠來源和擴增有限，也是限制car-m技術應用于過繼性細胞療法的關鍵因素。
5、因此，亟需其他可靠來源的巨噬細胞用于過繼性細胞療法。
技術實現思路
1、本專利技術涉及基于基因修飾的腹腔巨噬細胞或胸腔巨噬細胞構建car-巨噬細胞(car-m)。本專利技術還涉及將由腹腔巨噬細胞或胸腔巨噬細胞構建的car-m與化療藥物聯合用于腫瘤的治療。
2、第一方面，本專利技術提供了修飾的細胞，所述修飾的細胞包含或表達嵌合抗原受體(car)，其中所述嵌合抗原受體包含胞內結構域，跨膜結構與和胞外結構域，所述胞內結構域包括共刺激結構域和信號轉導結構域，所述胞外結構域包含抗原結合結構域，并且其中所述細胞是腹腔巨噬細胞或胸腔巨噬細胞。
3、在一些實施方案中，所述胞外結構域還包含鉸鏈結構域。
4、在一些實施方案中，所述鉸鏈結構域和跨膜結構域源自相同的蛋白。
5、在一些實施方案中，所述鉸鏈結構域和跨膜結構域源自不同的蛋白。
6、在一些實施方案中，所述鉸鏈結構域為cd8α鉸鏈結構域、igg鉸鏈結構域或cd28鉸鏈結構域。
7、在一些實施方案中，所述鉸鏈結構域源自cd8α，優選地，所述鉸鏈結構域是cd8α的胞外結構域。
8、在一些實施方案中，所述修飾的細胞包含編碼所述嵌合抗原受體(car)的多核酸分子。
9、在一些實施方案中，所述修飾的細胞包含質粒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體中的一種或幾種。
10、優選地，所述病毒載體為逆轉錄病毒載體或溶瘤病毒，例如慢病毒載體，優選為選自人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、維斯納-梅迪病毒(vmv)病毒、山羊關節炎-腦炎病毒(caev)、馬傳染性貧血病毒(eiav)、貓免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、腺病毒和痘病毒。
11、在一些實施方案中，所述腺病毒載體或者慢病毒載體包含編碼所述嵌合抗原受體(car)的多核酸分子。
12、在一些實施方案中，所述腺病毒載體為ad5f35腺病毒載體。
13、在一些實施方案中，所述共刺激結構域源自選自如下的共刺激分子：cd2、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、cd86、cd3、cd152、pd-1、icos、hvem、淋巴細胞功能相關抗原-1(lfa-1)、myd88、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、與cd83特異性結合的配體，及其任何組合。
14、在一些實施方案中，所述信號轉導結構域源自cd3ζ、fcεriγ、pkcθ或zap70中的至少一種。
15、在一些實施方案中，所述跨膜結構域將car的細胞外結構域和細胞內結構域連接，并將受體錨定于巨噬細胞膜上。
16、在一些實施方案中，所述跨膜結構域源于cd4、cd8α、cd28、cd2、cd27、cd137、cd80、cd86、ctla-4(cd152)、icos、ox40、程序性細胞死亡蛋白1(pd-1)、cd3ζ、fcεriγ、t細胞受體的α、β或ζ鏈、cd3ε、cd45、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd137和cd154。
17、在一些實施方案中，所述胞外結構域包括抗原結合結構域和鉸鏈結構域。
18、在一些實施方案中，所述抗原結合結構域結合腫瘤相關抗原(taa)。
19、在一些實施方案中，所述抗原結合本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.修飾的細胞，其包含或表達嵌合抗原受體(CAR)，其中所述嵌合抗原受體包含胞內結構域，跨膜結構與和胞外結構域，所述胞內結構域包括共刺激結構域和信號轉導結構域，所述胞外結構域包含抗原結合結構域，并且其中所述細胞是腹腔巨噬細胞或胸腔巨噬細胞。
2.根據權利要求1的修飾的細胞，所述胞外結構域還包含鉸鏈結構域，
3.根據權利要求1的修飾的細胞，其包含編碼所述CAR的多核苷酸。
4.根據權利要求1的修飾的細胞，其包含編碼所述CAR的多核苷酸的質粒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體中的一種或幾種，
5.根據權利要求1的修飾的細胞，所述共刺激結構域源自選自如下的共刺激分子：CD2、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD86、CD3、CD152、PD-1、ICOS、HVEM、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、Myd88、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合的配體，及其任何組合；和/或
6.根據權利要求4的修飾的細胞，其包含編碼所述CAR的慢
7.制備權利要求1-6任一項的修飾的細胞的方法，其包括從腹腔或胸腔分離巨噬細胞，以及將所述CAR引入所獲得的巨噬細胞中的步驟，或者將包括表達CAR的多核苷酸引入所獲得的巨噬細胞中的步驟。
8.根據權利要求7的方法，其包括從惡性腹水或惡性胸水分離巨噬細胞，以及將包括表達嵌合抗原受體(CAR)的多核苷酸引入所獲得的巨噬細胞中的步驟。
9.根據權利要求7或8的方法，其中利用載體將編碼嵌合抗原受體(CAR)的多核酸分子引入巨噬細胞中，
10.根據權利要求7或8的方法，其中利用慢病毒載體將編碼嵌合抗原受體(CAR)的多核酸分子引入巨噬細胞中，
11.藥物組合物，其包含權利要求1-6任一項的修飾的細胞或由權利要求7-10任一項的方法制備的修飾的細胞，和可藥用載體。
12.根據權利要求11的藥物組合物，還包含化療藥，所述化療藥選自順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、表柔比星、全反式維甲酸、放線菌素D、阿霉素、阿那曲唑、阿扎胞苷、白消安、硫唑嘌呤、馬法蘭、阿糖胞苷、依西美坦、柔紅霉素、埃坡霉素、三氧化二砷、氟達拉濱、BiCNU博來霉素、CCNU、卡培他濱、多西他賽、苯丁酸氮芥、伊達比星、羥基脲、環磷酰胺、胞嘧啶、光神霉素、DTIC、多西氟啶、5-氟尿嘧啶、拉帕替尼、依托泊苷、甲氨蝶呤、厄洛替尼、甲氧乙胺、哌替米特、巰基嘌呤、替尼泊苷、伊馬替尼、來曲唑、孕烯醇、勒他汀、噻鳥嘌呤、巰嘌呤、米絲裂霉素、他莫昔芬、納維賓米托蒽醌、曲美曲塞、托蒽醌、、氮芥、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠單抗、長春新堿、長春花堿、長春瑞濱、長春地辛、長春堿、纈沙星、VP-16和希羅達中的一種或多種。
13.根據權利要求11的藥物組合物，還包含免疫檢查點抑制劑，所述免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑，PD-L1抑制劑，CTLA-4靶向劑或免疫調節劑。
14.根據權利要求11的藥物組合物，還包含白介素1β(IL1β)，白介素6(IL6)，白介素12,(IL12)，重組人干擾素-γ(IFN-γ)，單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，活性氧和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)中的一種或者多種。
15.根據權利要求11的藥物組合物，其被配制成用于靜脈注射，腹膜注射或腹腔灌注的形式。
16.權利要求1-6任一項的修飾的細胞，由權利要求7-10任一項的方法制備的修飾的細胞，或權利要求11-15任一項的藥物組合物在制備用于治療對象中的腫瘤或癌癥的藥物中的用途。
17.根據權利要求16的用途，所述腫瘤或癌癥為胃癌、前列腺癌、腹膜癌、肺癌、乳腺癌，惡性淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、胃癌、肝癌、結腸癌和胰腺癌中的一種或多種。
...【技術特征摘要】
1.修飾的細胞，其包含或表達嵌合抗原受體(car)，其中所述嵌合抗原受體包含胞內結構域，跨膜結構與和胞外結構域，所述胞內結構域包括共刺激結構域和信號轉導結構域，所述胞外結構域包含抗原結合結構域，并且其中所述細胞是腹腔巨噬細胞或胸腔巨噬細胞。
2.根據權利要求1的修飾的細胞，所述胞外結構域還包含鉸鏈結構域，
3.根據權利要求1的修飾的細胞，其包含編碼所述car的多核苷酸。
4.根據權利要求1的修飾的細胞，其包含編碼所述car的多核苷酸的質粒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體中的一種或幾種，
5.根據權利要求1的修飾的細胞，所述共刺激結構域源自選自如下的共刺激分子：cd2、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、cd86、cd3、cd152、pd-1、icos、hvem、淋巴細胞功能相關抗原-1(lfa-1)、myd88、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、與cd83特異性結合的配體，及其任何組合；和/或
6.根據權利要求4的修飾的細胞，其包含編碼所述car的慢病毒載體，
7.制備權利要求1-6任一項的修飾的細胞的方法，其包括從腹腔或胸腔分離巨噬細胞，以及將所述car引入所獲得的巨噬細胞中的步驟，或者將包括表達car的多核苷酸引入所獲得的巨噬細胞中的步驟。
8.根據權利要求7的方法，其包括從惡性腹水或惡性胸水分離巨噬細胞，以及將包括表達嵌合抗原受體(car)的多核苷酸引入所獲得的巨噬細胞中的步驟。
9.根據權利要求7或8的方法，其中利用載體將編碼嵌合抗原受體(car)的多核酸分子引入巨噬細胞中，
10.根據權利要求7或8的方法，其中利用慢病毒載體將編碼嵌合抗原受體(car)的多核酸分子引入巨噬細胞中，
11.藥物組合物，其包含權利要求1-6任一項的修飾的細胞或由權利要求7-1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈萍萍，陳一軍，章文龍，
申請(專利權)人：南京元邁細胞生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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