【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，特別涉及一種用于數(shù)字pcr檢測的血液微生物dna提取方法。
技術(shù)介紹
1、血流感染是指病原微生物侵入人體血液系統(tǒng)，并在血液系統(tǒng)中快速繁殖，造成人體全身系統(tǒng)性感染的疾病。免疫力低下以及機(jī)體免疫屏障功能受到損傷(如，手術(shù)、靜脈留置針、燒傷、氣管插管等)的老人和兒童更容易成為病原菌侵入血液的主要人群。目前血流感染發(fā)病率與死亡率均較為嚴(yán)重。全球每年約有1800萬以上的血流感染病例，并且是重癥監(jiān)護(hù)室病區(qū)最為常見的死亡病因。多項研究表明，革蘭氏陽性菌造成的血流感染呈上升趨勢，革蘭氏陰性菌趨于穩(wěn)定但耐藥菌株顯著增加。而真菌病的發(fā)生率隨著接受免疫抑制療法(例如化學(xué)療法)的人群的增加而大大增加。臨床中常見的血流感染為菌血癥、敗血癥等疾病。血液中被檢測到有致病菌的存在且無明顯毒血的癥狀被定義為菌血癥；而侵入血循環(huán)中的致病菌產(chǎn)生多種毒素而發(fā)生全身性感染的情況被定義為敗血癥。敗血癥如不及時控制，則會由原發(fā)部位的感染發(fā)展成為機(jī)體其他多個部位的感染，常常引起膿腫可根據(jù)感染部位的不同繼發(fā)腦膜炎、心膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎等疾病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致感染性休克甚至危及生命安全。
2、目前血流感染檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)是血液培養(yǎng)，該技術(shù)專利技術(shù)于19世紀(jì)中葉，經(jīng)過長期的發(fā)展以及現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)已經(jīng)迭代到無需人工操作，完全由機(jī)器替代，自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)能夠?qū)ξ⑸锎x產(chǎn)生的氣體進(jìn)行監(jiān)測，從而判斷樣本的感染情況。但是血液培養(yǎng)也不可避免的具有一定的局限性，如假陽性和假陰性錯誤，檢驗(yàn)周期長等等。而血流感染具有發(fā)病周期短、病情進(jìn)展快速等特性，如果未能在患
3、數(shù)字pcr技術(shù)也稱為第三代pcr技術(shù)，是一種核酸高靈敏檢測和絕對定量的新方法。同傳統(tǒng)的pcr相比，數(shù)字pcr增加了對反應(yīng)體系進(jìn)行分隔(partition)的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了數(shù)萬微小獨(dú)立反應(yīng)體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個微滴中含有1個分子的核酸模板，擴(kuò)增完成后對所有的液滴進(jìn)行熒光信號識別并計數(shù)，計算出陰性和陽性反應(yīng)的數(shù)量，通過泊松分布原理計算靶標(biāo)分子的濃度，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對定量。數(shù)字pcr不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，并且不受pcr擴(kuò)增效率影響，具有更高靈敏度和準(zhǔn)確度。因此若將數(shù)字pcr技術(shù)應(yīng)用于血流感染檢測領(lǐng)域，將極大地縮短檢測時間，為患者的早期診治提供重要的依據(jù)。
4、由于大量的人源基因組會對病原菌核酸的檢測(尤其是數(shù)字pcr)產(chǎn)生干擾，同時提取過程中過量蛋白對于核酸純度的影響較大，因此提供能夠去除血液樣本中的人源基因組、降低雜蛋白影響的核酸提取方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)提供了一種用于數(shù)字pcr檢測的血液微生物dna提取方法，能夠去除血液樣本中的人源基因組、降低雜蛋白對于核酸純度的影響。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了用于提取血液樣本中微生物的核酸的試劑盒，其包含血細(xì)胞裂解液和/或裂解液；
4、所述血細(xì)胞裂解液的ph值為6.5～8，包含：10～50mm?tris-hcl緩沖液、50～500mmnh4cl、10～100mm?khco3、2～10mm?edta-na2和0.1％～2％(v/v)聚乙二醇單辛基苯基醚；
5、所述裂解液的ph為6～8，包含：1～4m異硫氰酸胍、2～5m鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mm?tris-hcl緩沖液、5～20mm?edta、0.1～1m?nacl、1％～10％(w/w)peg8000和10％～60％(v/v)異丙醇。
6、本專利技術(shù)還提供了血液樣本中微生物的核酸提取方法，步驟包括：先將待測血液樣本分離為血漿和血細(xì)胞，取所述血細(xì)胞與血細(xì)胞裂解液混合后分離出上清和沉淀，取所述沉淀與所述血漿混合，獲得預(yù)處理樣本，取核酸提取裂解液與所述預(yù)處理樣本混合后采用磁珠法對所述預(yù)處理樣本進(jìn)行核酸提取，獲得核酸；
7、所述血細(xì)胞裂解液包含10～50mm?tris-hcl緩沖液、50～500mm?nh4cl、10～100mmkhco3、2～10mm?edta-na2和0.1％～2％(v/v)聚乙二醇單辛基苯基醚；
8、所述血細(xì)胞裂解液的ph值為6.5～8。
9、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里，所述核酸提取裂解液包含1～4m異硫氰酸胍、2～5m鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mm?tris-hcl緩沖液、5～20mm?edta、0.1～1m?nacl、1％～10％(w/w)peg8000和10％～60％(v/v)異丙醇；
10、所述核酸提取裂解液的ph為6～8。
11、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法包括如下步驟：
12、步驟(1)：取待測全血樣本，離心，分離血漿和血細(xì)胞；
13、步驟(2)：取血細(xì)胞裂解液與等量的所述血細(xì)胞混勻，離心，獲得沉淀；
14、步驟(3)：取所述血漿與所述沉淀混勻，獲得預(yù)處理樣本；
15、步驟(4)：取裂解液、磁珠與所述預(yù)處理樣本混合，超聲裂解；
16、步驟(5)：洗滌所述磁珠后，洗脫，獲得核酸；
17、所述血細(xì)胞裂解液包含10～50mm?tris-hcl緩沖液、50～500mm?nh4cl、10～100mmkhco3、2～10mm?edta-na2和0.1％～2％(v/v)聚乙二醇單辛基苯基醚；
18、所述血細(xì)胞裂解液的ph值為6.5～8。
19、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(1)中所述離心的條件為800～3000g，1～20min。
20、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(2)中所述等量指的是質(zhì)量相同。
21、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(2)中所述等量指的是體積相同。
22、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(2)中所述離心的條件為9000～11000g，2～8min。
23、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(4)中所述裂解液1～4m異硫氰酸胍、2～5m鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mm?tris-hcl緩沖液、5～20mm?edta、0.1～1m?nacl、1％～10％(w/w)peg8000和10％～60％(v/v)異丙醇；
24、所述核酸提取裂解液的ph為6～8。
25、在本專利技術(shù)的一些具體實(shí)施方案中，上述核酸提取方法里步驟(5)中所述洗滌所用的洗滌液包括洗滌液1和/或洗滌液2；
26、所述洗滌液1含有40％～70％(w/w)異硫氰酸胍、20～200mm?tris-hcl緩沖液、20％～60％(v/v)乙醇和0.2本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.用于提取血液樣本中微生物的核酸的試劑盒，其特征在于，包含血細(xì)胞裂解液和/或裂解液；
2.血液樣本中微生物的核酸提取方法，其特征在于，先將待測血液樣本分離為血漿和血細(xì)胞，取所述血細(xì)胞與血細(xì)胞裂解液混合后分離出上清和沉淀，取所述沉淀與所述血漿混合，獲得預(yù)處理樣本，取核酸提取裂解液與所述預(yù)處理樣本混合后采用磁珠法對所述預(yù)處理樣本進(jìn)行核酸提取，獲得核酸；
3.如權(quán)利要求2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取裂解液的pH為6～8，包含1～4M異硫氰酸胍、2～5M鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mM?Tris-HCl緩沖液、5～20mM?EDTA、0.1～1M?NaCl、1％～10％(w/w)PEG8000和10％～60％(v/v)異丙醇。
4.如權(quán)利要求2所述的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的核酸提取方法，其特征在于，步驟(1)中所述離心的條件為800～3000g，1～20min。
6.如權(quán)利要求4或5所述的核酸提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述裂解液的pH
7.如權(quán)利要求4至6任一項所述的核酸提取方法，其特征在于，步驟(5)中所述洗滌所用的洗滌液包括洗滌液1和/或洗滌液2；
8.待測樣本為血液樣本的非診斷目的的數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，所述待測樣本的核酸提取按照如權(quán)利要求2至7任一項所述的核酸提取方法提取。
9.如權(quán)利要求8所述的數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，先將待測血液樣本分離為血漿和血細(xì)胞，取所述血細(xì)胞與血細(xì)胞裂解液混合后分離出上清和沉淀，取所述沉淀與所述血漿混合，獲得預(yù)處理樣本，取核酸提取裂解液與所述預(yù)處理樣本混合后采用磁珠法對所述預(yù)處理樣本進(jìn)行核酸提取，獲得核酸；
10.如權(quán)利要求9所述的數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，所述核酸提取裂解液的pH為6～8，包含1～4M異硫氰酸胍、2～5M鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mMTris-HCl緩沖液、5～20mM?EDTA、0.1～1M?NaCl、1％～10％(w/w)PEG8000和10％～60％(v/v)異丙醇。
...【技術(shù)特征摘要】
1.用于提取血液樣本中微生物的核酸的試劑盒，其特征在于，包含血細(xì)胞裂解液和/或裂解液；
2.血液樣本中微生物的核酸提取方法，其特征在于，先將待測血液樣本分離為血漿和血細(xì)胞，取所述血細(xì)胞與血細(xì)胞裂解液混合后分離出上清和沉淀，取所述沉淀與所述血漿混合，獲得預(yù)處理樣本，取核酸提取裂解液與所述預(yù)處理樣本混合后采用磁珠法對所述預(yù)處理樣本進(jìn)行核酸提取，獲得核酸；
3.如權(quán)利要求2所述的核酸提取方法，其特征在于，所述核酸提取裂解液的ph為6～8，包含1～4m異硫氰酸胍、2～5m鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌氨酸鈉、50～100mm?tris-hcl緩沖液、5～20mm?edta、0.1～1m?nacl、1％～10％(w/w)peg8000和10％～60％(v/v)異丙醇。
4.如權(quán)利要求2所述的核酸提取方法，其特征在于，包括如下步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的核酸提取方法，其特征在于，步驟(1)中所述離心的條件為800～3000g，1～20min。
6.如權(quán)利要求4或5所述的核酸提取方法，其特征在于，步驟(4)中所述裂解液的ph為6～8，包含1～4m異硫氰酸胍、2～5m鹽酸胍、1％～5％(w/w)月桂酰基肌...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏江，柏忠良，余皓，
申請(專利權(quán))人：領(lǐng)航基因科技杭州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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